RELATORE INTERNO: Prof.ssa LORETTA TUOSTO RELATORE ESTERNO: Dott.ssa CAROLINA SCAGNOLARI

1. “ANALISI DELL’INFLUENZA DEI FATTORI DI RESTRIZIONE INTERFERON INDOTTI SULLA REPLICAZIONE E VARIABILITÀ GENETICA DEL VIRUS DELL’IMMUNODEFICIENZA UMANA 1” RELATORE INTERNO: Prof.ssa LORETTA TUOSTO RELATORE ESTERNO: Dott.ssa CAROLINA SCAGNOLARI CANDIDATA: GIULIA RIBELLI

2. 1957: SCOPERTA IFN RESISTENZA ALL’INFEZIONE

3. SIGNALING ATTIVATO DALL’IFN λ4 ε δ ω κ τ 2’-5’ OAS ISGs P56 ISG15 APOBEC3F APOBEC3G SAMHD1 MxA PKR

4. RUOLO DICOTOMICO DELL’IFN I IN HIV-1 Azione Immunomodulatoria Azione Antivirale Azione Immunomodulatoria Effetti del signaling dell’IFN di I tipo Azione Antivirale Immunosoppressione Infezione Cronica da HIV Infezione Acuta da HIV Attivazione delle risposte adattative IFN Danno tissutale Azione antivirale diretta IFN NatRevImmunol. 2014 NatRevImmunol. 2014

5. INTERFERON STIMULATED GENE 15 (ISG15) J. Mol. Biol. (2013) 425, 4995–5008

6. CellMolBiol. 2006 15;52(1):29-41. ISG15 enhances the innate antiviralresponsebyinhibitionof IRF-3 degradation. Lu G(1), Reinert JT, Pitha-Rowe I, Okumura A, Kellum M, Knobeloch KP, Hassel B, Pitha PM. GENES & DEVELOPMENT, 2003 ?

7. FAMIGLIA APOBEC (APOLIPOPROTEIN B MRNA-EDITING, ENZYME-CATALYTIC, POLYPEPTIDE-LIKE) • APOBEC3F • APOBEC3G ATTIVITÀ ANTIVIRALE IN VITRO CONTRO HIV HYPERMUT 2.0 hypermut APOBEC3G RICONOSCE SEQUENZA CONSENSUS TGG E LA MUTA IN TAA APOBEC3F RICONOSCE SEQUENZA CONSENSUS TGA E LA MUTA IN TAA DEGRADAZIONE DEL GENOMA IPERMUTATO O GENESI DI VIRIONI DIFETTIVI

8. OBIETTIVI IRFs Acute HIV infection Chronic HIV infection ? PRRs IFNs Sensing ISGs JAKs/STATs Viralreplication • VALUTARE ESPRESSIONE ISGs NEI SANI E NEI PAZIENTI HIV-1 POSITIVI • VALUTARE SE CI SONO CORRELAZIONI TRA GLI ISGs E I PRINCIPALI MARKERS VIROIMMUNOLOGICI • VALUTARE IL TASSO DI IPERMUTAZIONE INDOTTO DA APOBEC3F E APOBEC3G NEL GENOMA VIRALE

9. CARATTERISTICHE DEMOGRAFICHE E CLINICHE DEI PAZIENTI HIV-1 POSITIVI • 1Dati espressi come media ± SD, mediana (range) or percentuale. Differenczenellecaratteristichedemografichetrapazienti HIV-1 positivi e soggettisanisono state valutatemediante Student's t and Chi-squared tests. 2La caricavirale è statadeterminataattraversosaggio HIV-1 RNA kPCR (Siemens Healthcare Diagnostic, Tarrytown NY) che ha un limitedirilevazionedi 37copies/ml. 3NA=not applicable

10. CONFRONTO DELL’ESPRESSIONE GENICA RELATIVA DEGLI ISGs TRA PAZIENTI HIV-1 NAIVE E INDIVIDUI SANI * * Livelli dell’mRNA di ISGs(relativi alla β-glucoronidasi) * * * p< 0.05

11. CONFRONTO DELL’ESPRESSIONE GENICA DEGLI ISGs NEI PAZIENTI HIV-1 POSITIVI NAIVE PER IL TRATTAMENTO HAART *p< 0.05

12. ISG15 E VIREMIA Livelli dell’mRNA di ISG15 (relativi alla β-glucoronidasi) * *p< 0.05

13. ISG15 E LINFOCITI T CD4+ Livelli dell’mRNA di ISG15 (relativi alla β-glucoronidasi) * *p< 0.05

14. ISG15 E HIV-1 DNA INTEGRATO Livelli dell’mRNA di ISG15 (relativi alla β-glucoronidasi) Valore mediano di HIV-1 DNA integrato= 202. 92 copies/106PBMCs

15. RELAZIONE TRA I LIVELLI DEGLI ISGs E I MARKERS VIRO-IMMUNOLOGICI IN PAZIENTI HIV-1 POSITIVI NAIVE

16. VALUTAZIONE DEI LIVELLI D’ESPRESSIONEDI ISG15 NEI PAZIENTI HIV POSITIVI IN CORSO DELLA TERAPIA ANTIRETROVIRALE HAART * Livelli dell’mRNA di ISG15 (relativi alla β-glucoronidasi) * p< 0.05

17. VALUTAZIONE ESPRESSIONE GENICA RELATIVA DEGLI ISGs REAL-TIME PCR + IFNα2b 5 ng/ml DONATORI SANI PBMCs P56 ISG15 APOBEC3F APOBEC3G * * * T6 T24 T48 T72 * p< 0.05

18. ESPRESSIONE GENICA DI ISG15 NEI DIVERSI GENOTIPI DI • rs1921 E rs15842 CROMOSOMA 1 p36.33 DNA SANI, NAIVE E TRATTATI TAQMAN SNP GENOTYPING ASSAY ISG15 C T rs 1921 rs 15842 G A 13.33% 70% 16.67% 13.98% 72.04% 13.98% 26.67% 50% 23.33% 86.67% 6.67% 10% 86.02% 6.45% 7.53% 83.33% 6.67% 10%

19. ANALISI DELLE IPERMUTAZIONE INDOTTE DA APOBEC3F E APOBEC3G NEL GENOMA HIV INTEGRATO NEI PBMC SEQUENZE ENV OTTENUTE DAI 93 PAZIENTI NAIVE ALLLINATE MEDIANTE BIOEDIT CON SEQUENZE HXB2* DI RIFERIMENTO DEL GENE ENV CARICAMENTO SEQUENZE SU HYPERMUT ANALISI DELLE IPERMUTAZIONI INDOTTE DA APOBEC3F E APOBEC3G *(Hahn BH et al., Nature. 1984)

20. CALCOLO DEL p VALUE DI FISHER SUL RATE RATIO RAPPORTO TRA LE IPERMUTAZIONI INDOTTE DA APOBEC3F E APOBEC3G E QUELLE DI CONTROLLO, CHE RICADONO IN SEQUENZE DIVERSE DA QUELLE CONSENSUS RICONOSCIUTE DALLE DUE APOLIPOPROTEINE APOBEC3G MUTA TGG IN TAA APOBEC3F MUTA TGA IN TAA SOLO 3 SEQUENZE DI 93 MOSTRANO UN TASSO DI IPERMUTAZIONE SIGNIFICATIVO

21. CONCLUSIONI ISG15 CORRELA CON VIREMIA E CONTA LINFOCITI CD4+ MA NON CON L’HIV-DNA INTEGRATO IN VITRO ISG15 NON RISULTA ESSERE L’ISGS PIÙ ESPRESSO GLI SNPsDI ISG15 (rs1921 rs15842) ANALIZZATI NON INFLUNZANO L’ESPRESSIONRE I DI ISG15 IN PAZIENTI HIV-1 POSITIVI GLI ISGs ANALIZZATI SONO UPREGOLATI NEI PAZIENTI HIV-POSITIVI RISPETTO AI CONTROLLI SANI NEI PAZIENTI HIV-1 POSITIVI IL GENE PIÙ ESPRESSO È ISG15 IL TASSO DI IPERMUTAZIONI INDOTTE DAGLI ENZIMI APOBEC3F E APOBEC3G NEL GENOMA DI HIV-1 È PARI AL 3.2%

22. RINGRAZIAMENTI: PROF.SSA LORETTA TUOSTO DOTT.SSA CAROLINA SCAGNOLARI DOTT.SSA GIULIA CACCIOTTI E TUTTO IL LABORATORIO DI VIROLOGIA.