Physiologie et exploration de l’hémostase 11/10/11-P2

1. Physiologieet exploration de l’hémostase 11/10/11-P2 2e partie Annie Bezeaud, Faculté Médecine Université D. Diderot – Paris7 Lectures conseillées: Poly d’hémostase P2:il y a TOUT Abrégé d’Hématologie (Masson) ed 2008 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

2. Mots cles médecine générale Embolie pulmonaire réanimation thrombose obstétrique maladies du foie aspirine cardiologie AVC infarctus hémophile anticoagulants phlébite Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

3. IV- L’initiation de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

4. Facteur tissulaire (FT): 1- co-facteur de l’auto-activation du FVII par le FVIIa VII VIIa SP SP Dans le sang: FVII (pro-enzyme) + traces de FVIIa (inactif en absence de FT. EGF2 FT EGF2 FT EGF1 EGF1 Gla Gla Ca++ Ca++ Phosphatidylsérine (PS) Fibroblaste Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

5. FIXa, FXa Facteur tissulaire (FT): 2- co-facteur de l’activation du FIX et du FX par le FVIIa FVIIa SP FIX, FX EGF2 SP EGF2 EGF1 EGF1 La liaison Ca++ et Gla dépendante entre VIIa, IX, X et Phospholipides (-) est indispensable à l’activation du IX et du X. Gla Gla Ca++ Ca++ Phosphatidylsérine (PS) FT Fibroblaste Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

6. Hémostase = obstruction d’une brèche vasculaire Fibroblaste Adventice FT Media VIIa FW IX VIIIa IXa II X Va Xa Fibrine IIa Fibrinogène Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

7. A retenir: IV- L’initiation de la coagulation • La coagulation est initiée lorsque une protéine membranaire, le • Facteur tissulaire (adventice, epithelium) vient au contact du sang • (blessure vasculaire) • Inséré dans la bicouche de phospholipides membranaires, il interagit • avec le VII/VIIa = auto-activation du VII • activation du IX et du X par le VIIa • Pathologie: l’expression du FT peut être induite par les médiateurs de • l’inflammation dans des cellules circulantes (monocytes) ou • Vasculaires (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

8. V- La propagation et l’amplification de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

9. Amplification de la coagulation • Les 1ères traces de thrombine: • activent les co-facteurs (FV et FVIII) • recrutent et activent de nouvelles plaquettes • activent le FXI Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

10. Fibroblaste Adventice Sous-endothelium FT F.Willebrand VIIa VII XIIa XII KHPM KHPM XIa PK XI IX K IX IXa IXa La thrombine amplifie sa formation VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa II Va XI II V Thrombine Plaquette PAR Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

11. IXa VIIIa Complexe tenase X Xa II Va Complexe prothrombinase Xa IIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

12. A retenir: V- La propagation et l’amplification de la coagulation • Les réactions enzymatiques de la coagulation (réactions protéolytiques) se propagent à la surface des plaquettes amarrées à la brèche vasculaire • Grâce à la fixation des facteurs vitamine K-dépendants à la phosphatidylsérine externalisée par les plaquettes activées • Les 1ères traces de thrombine formées amplifient les réactions: • Activation des co-facteurs (FV et FVIII) et formation des complexes tenase et prothombinase (conditions cinétiques optimales) • Recrutement et activation de nouvelles plaquettes (surface catalytique + grande) • Activation du FXI voie alterne de production de thrombine Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

13. VI- Les multiples fonctions de la thrombine • Auto-amplification de sa production par activation des co-facteurs (FV, FVIII) et du FXI. • Conversion du fibrinogène en fibrine • Activation cellulaire • Rôle dans la régulation de la coagulation (systeme de la protéine C) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

14. Conversion du fibrinogène en fibrine 1. Protéolyse du fibrinogène par la thrombine Fibrinogène Fibrine a a a a A A b b b b B B g g g g Thrombine + fibrinopeptides A et B Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

15. Conversion du fibrinogène en fibrine 2. Polymérisation des monomères de fibrine a GPR b GHR g g g g b b a a Liaison hydrogène Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

16. Conversion du fibrinogène en fibrine 3. Stabilisation de la fibrine GPR RPG GHR RHG g g b b a a Ca++ Ca++ XIIIa XIII Liaison covalente Thrombine Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

17. A retenir: • Conversion du fibrinogène en fibrine • La thrombine scinde 2 FpA et 2 FpB des chaînes Aa et Bb respectivement, convertissant le fibrinogène en monomère de fibrine soluble • Le clivage des Fp démasque des sites de polymérisation qui permettent d’établir des liaisons hydrogène entre monomères: polymère de fibrine solide mais instable • Association de monomères bout à bout (longitudinale) puis latérale: épaissisement des fibres • Parallèlement, la thrombine active le FXIII par protéolyse des sous-unités a. Le démasquage du site actif du XIIIa nécessite le Ca2+ et la fibrine. Fixé à l’extrémité C-ter des chaînes a, le XIIIa établit des liaisons covalentes entre une Gln (donneur) et une Lys (accepteur) des chaînes a et des chaînes g: polymère de fibrine solide et stable • Fp: fibrinopeptide (A:18 aa, B:16aa) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

18. VI- Le système du contact ( ou voie endogène) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

19. Fibroblaste Adventice Sous-endothelium FT F.Willebrand VIIa VII XIIa XII KHPM KHPM XIa PK XI IX K IX IXa IXa VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa II Va XI II V Thrombine Plaquette PAR Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

20. Sous-endothelium FW XIIa XII KHPM KHPM Activation de IX XI XIa PK K la coagulation IXa Fibrinogène VIIIa X Xa Activation du Activation de Va complément la fibrinolyse II Pg Pe Thrombine K PK scuPA tcuPA BK KHPM bradykinine Production de substances Sous-endothelium vaso-actives Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

21. VII- Le contrôle de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

22. La coagulation est sous le contrôle de l’endothélium Fibroblaste Adventice FT Media VIIa FW IX VIIIa IXa Flux II X Va Xa Fibrine IIa Fibrinogène AT AT TFPI TM GAGs GAGs PC Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot EPCR

23. -e-Les inhibiteurs plasmatiques • Antithrombine (AT) Synthétisée par le foie, « activée » par la liaison aux glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire ou à l’héparine les autres serpines: Cofacteur II de l’Héparine, alpha 1 Anti Trypsine • Système de la Protéine C - protéine C zymogène produit par l’hépatocyte - protéine S cofacteur produit par l’hépatocyte et la cellule endothéliale - 2 récepteurs: Thrombomoduline et EPCR ( endothelial protein C receptor) • TFPI ( tissue factor pathway inhibitor ) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

24. L’Antithrombine est une serpine activée par l’héparane Sulfate des cellules endothéliales Xa Xa thrombine thrombine IXa vWF VIIIa IXa AT II X AT Va Xa Fibrine AT Fibrinogene AT AT AT AT Heparane sulfate Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

25. Héparine et interaction Antithrombine (AT) / protéases -A- -B- AT AT AT IIa Xa Xa HBPM HNF HNF Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

26. Le système de la PC, activé à la surface de l’endothélium, régule les co-facteurs Va et VIIIa • La liaison de la thrombine à la thrombomoduline (TM) supprime ses activités pro-coagulantes. • Le complexe thrombine/TM active la Protéine C (PC), liée à la TM et à son récepteur endothélial (EPCR). • La PC activée (PCa) dégrade les FVa et FVIIIa, en présence de protéine S (PS), sur la surface des plaquettes activées. • Les FVi et FVIIIi n’ont plus d’activité co-facteur. VIIIi Vi (2b) (2a) TM IIa PCa VIIIa (1) PCa Va PS PS PCa PC EPCR Endothelium FW FW Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

27. Xa TFPI TFPI TFPI TFPI Régulation de la coagulation par le TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) FT FT VIIa VIIa IX IXa VIIIa Xa X Va Xa Ca ++ II Thrombine Glycosaminoglycanes Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot TFPI-2

28. A retenir: • Régulation négative de la coagulation • L’antithrombine est une serpine (inhibiteur de sérine protéases) dont l’activité est potentialisée par l’héparane sulfate des parois vasculaires. Elle forme des complexes irréversibles inactifs avec la thrombine, le FXa, les FIXa et XIa, lorsque ceux-ci ne sont pas fixés sur les surfaces membranaires. • Système de la protéine C: 2 protéines membranaires endothéliales (thrombomoduline et EPCR) potentialisent l’activation de la protéine C par la thrombine. La protéine C activée (avec son co-facteur la protéine S) dégrade les co-facteurs Va et VIIIa, et ralentit la production de thrombine. • Le TFPI, fixé sur les glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire, forme un complexe avec le FXa. Le complexe FXa-TFPI se fixe sur le complexe FT-FVIIa et bloque l’initiation de la coagulation par le facteur tissulaire (FT). Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

29. VIII- La fibrinolyse Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

30. Fibrinolyse: Les intervenants • 1- Une surface : le réseau de fibrine • 2- Les protéines plasmatiques: - Activateurs • Plasminogène: synthèse hépatique, zymogène de sérine protéase ( plasmine) • tPA: serine protéase, principalement synthétisée par la cellule endothéliale (CE) • ProUrokinase-Urokinase:sécrétée sous forme inactive (pro-uPA) par de nombreuses cellules. Pour qu’uPA soit active, le pro-uPA doit se lier à son récepteur membranaire spécifique: uPAR. intervient alors dans les processus de dégradation de la matrice extracellulaire • en activant des métalloprotéases. - Inhibiteurs • PAI1: serpine, produite par la CE, le foie : inactive tPA et UPA • α2 antiplasmine: synthetisée par le foie • TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor):élimine les résidus lysine qui permettent à la fibrine d'être reconnue par le plasminogène ou la plasmine. Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

31. Plasmine tPA Pg Fibrine Le système plasminogène-plasmineDigestion de la fibrine (1) PAI-1 tPA PAI-1 tPA PAI-1 PDF solubles Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

32. Le système plasminogène-plasmineDigestion de la fibrine (2) tPA Pg Fibrine Pn PDF solubles a2-antiplasmine (Foie) TAFI( Foie) (pro-carboxypeptidase B) Contrôle: PAI-1 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

33. A retenir: • Système plasminogène-plasmine • Le plasminogène (Pg) et son activateur plasmatique (tPA) se fixent sur la fibrine. Cette fixation protège le tPA de son inhibiteur (PAI-1) = le tPA active le Pg et la plasmine produite solubilise la fibrine (fibrinolyse) • Dans la paroi du vaisseau, le Pg et ses activateurs (uPA et tPA) se fixent sur des récepteurs cellulaires (cellule endothéliale, cellule musculaire lisse). Cette fixation protège l’uPA et le tPA de leurs inhibiteurs (PAI-1, PN-1) = le Pg est transformé en plasmine qui active des métalloprotéases et des facteurs de croissance (remodelage vasculaire) • Le système est régulé négativement par le PAI-1 et l’a2- antiplasmine qui forment des complexes irréversibles inactifs avec le tPA ou uPA, et la plasmine, respectivement, lorsque les enzymes diffusent à distance de la fibrine. Le TAFI, activé par la thrombine, hydrolyse le Pg et l’empêche de se fixer à la fibrine. Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

34. Exploration de l’hémostase • Des tests qui explorent: • L’hémostase primaire : temps de saignement • temps d’occlusion plaquettaire • La coagulation plasmatique : tests globaux • temps de Quick (TQ) • temps de céphaline+activateur ( TCA) • dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

35. Exploration de l’hémostase • Des tests qui explorent: • L’hémostase primaire : temps de saignement • temps d’occlusion plaquettaire • La coagulation plasmatique : tests globaux • temps de Quick (TQ) • temps de céphaline+activateur ( TCA) • dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

36. Temps de saignement - Méthode d'Ivy-incision N < 10 min F.Willebrand / collagène - Explore : . nombre et qualité des Fibrinogène ADP plaquettes TxA2 . F.Willebrand, fibrinogène . qualité du vaisseau - Fonction de l'hématocrite - Limites : . valeur prédictive du saignement médiocre . reproductibilité imparfaite, opérateur dépendant . sensibilité limitée . fiabilité faible en cas d'anomalie cutanée • Alternative: analyseur des fonctions plaquettaires (PFA) sur un prélèvement sanguin Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

37. Temps d’occlusion plaquettaire • PFA-100 (Dade-Behring) • Le sang du patient prélevé sur anticoagulant est analysé • sur la machine, passage sur 2 cartouches • Collagène+adrénaline et Collagène+ADP http://fmc.med.univ-tours.fr/Pages/Hemato/DES/B36.pdf -détermine le temps compris entre le début du test et l’obstruction complète par les plaquettes = TO temps d’occlusion en secondes. Explore : Nombre et qualité des Plaquettes F.Willebrand, fibrinogène Limites: thrombopénie, hématocrite bas Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

38. Exploration de l’hémostase • Des tests qui explorent: • L’hémostase primaire : temps de saignement • temps d’occlusion plaquettaire • La coagulation plasmatique : tests globaux • temps de Quick (TQ) • temps de céphaline+activateur ( TCA) • dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

39. Le sang est prélevé Sur un chélateur du calcium (citrate par exemple) Afin de bloquer la coagulation 1 2 Le tube de sang est centrifugé à 2500g Pendant 10 minutes x 2 fois Pour initier la coagulation, il faudra ajouter - du Ca2+, et des phospholipides - Puis - soit du FT (TQ) pour activer le F.VIIa - soit « un contact (TCA)-kaolin, silice etc… Le plasma est conservé pour réaliser les tests; il ne contient ni plaquettes, ni phospholipides et le Ca2+ est bloqué 3 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot 4

40. Pour réaliser un test, il faut initier la coagulation, donc ajouter ce qui manque: • du Ca2+, et des phospholipides (surfaces plaquettes) • Puis • - soit pour réaliser un TQ : du FT pour activer le F.VII du plasma. • - soit pour réaliser un TCA : « un contact: kaolin, silice etc… tube Automate d’hémostase Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

41. Mode de calcul du temps de Quick (TQ) • Etalonnage à partir d’un pool de plasma normal. • Mesure du temps du pool pour chaque dilution • 50% > TQ du Pool au 1/2 • 33 % > TQ du Pool au 1/3 • 25 % > TQ du Pool au ¼ • régression semi Log • Mesure de l’échantillon inconnu: • on porte le temps sur la droite et on en déduit un % Ici: temps de Quick: 20 sec • Correspond à 40% sur la droite • Normale TQ> 70% 20’’ 40% Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

42. + PL FT VIIa VII XIIa XII KHPM KHPM IX XIa PK XI IX K Ajout de quantités tres importantes de FT IXa IXa VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa TQ II Va XI II V Thrombine Plaquette PAR Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

43. Temps de Quick ( TQ) C’est un temps ( en s) il est exprimé en % de la normale N > 70 % Thromboplastine = phospholipides + facteur tissulaire Ca++ X VII VIIa Voie Xa Va exogène II Thrombine Fibrinogène Fibrine INR: réservé au TQ sous AVK Tronc commun Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

44. Temps de céphaline + activateur (TCA) Exprimé en secondes: N< T+6 à 8 sec Ou en ratio P/T <= 1.2 Céphaline: phospholipides Activateur + Ca++ F. XII, KHPM, PK IX XIa XI X VIIIa IXa Voie endogène Xa Va II Thrombine Fibrinogène Fibrine Tronc commun Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

45. Exploration de l’hémostase • Des tests qui explorent: • L’hémostase primaire : temps de saignement • temps d’occlusion plaquettaire • La coagulation plasmatique : tests globaux • temps de Quick (TQ) • temps de céphaline+activateur ( TCA) • dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

46. - Tous les facteurs de la coagulation se mesurent séparément - Leur taux est exprimé en % de la normale Exemple: dosage de F. X, ou F.VII etc… - Le dosage est un dosage fonctionnel: le résultat s’exprime en % ( N> 70%) - En cas d’anomalie, on peut envisager des explorations spécialisées ( dosage de l’Antigène par exemple) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

47. Très Important Apprenez sur votre poly Pour les passionnés: contacts Annie Bezeaud Bichat-poste 58 520 Ne lisez pas les vieilleries !!! Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot