Invalidation du gène Tph1 chez la souris

1. Invalidation du gène Tph1 chez la souris Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007

2. La découverte de la sérotonine • Erspamer & Vialli, 1937 • Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des muscles lisses: elle est nommée entéramine. • Rapport et coll., 1948 • Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux: elle est appelée sérotonine. • Erspamer & Asero, 1952 • Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance. • Twarog & Page, 1954 • La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est présente dans le cerveau des mammifères.

3. Système cardiovasculaire • Système sanguin • contractilité cardiaque • tonus vasculaire • fonction des lymphocytes • hémostase • Développement embryonnaire • Système gastro-intestinal • différenciation neuronale • synaptogenèse • division cellulaire • morphogène • développement cardiaque • péristaltisme La sérotonine: fonctions biologiques • Système nerveux central • thermorégulation • nociception • mémoire et apprentissage • cycle veille/sommeil • comportement sexuel/maternel • prise alimentaire • humeur

4. Système cardiovasculaire • Système sanguin • hypertension artérielle systémique et pulmonaire • cardiopathie hypertrophique • cardiopathie dilatée • asthme • thrombose • Système gastro-intestinal • Développement embryonnaire • tumeurs carcinoïdes • syndrome du colon irritable • retard de croissance La sérotonine: pathologies associées • Système nerveux central • schizophrénie • douleur • anxiété • dépression • comportements suicidaires • agressivité • migraine • alcoolisme

5. Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaqueschez la souris. Les acteurs du système 5-HT1/ des récepteurs spécifiques • 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes. • Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à l’exception du récepteur 5-HT3. • Expression dépendante de l’organe et de l’espèce considérés. 5-HT Na+ R.à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT3) Na+ Signalisation intracellulaire

6. Recapture 5-HT 5-HT R. Int. Ext. SERT 5-HT 5-HT • Un mécanisme de recapture: • Le transporteur de haute affinité SERT Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation Na+ R. canaux (5-HT3) R. à 7 domaines transmembranaires Na+ Signalisation intracellulaire

7. 5-HT MAO 5-HIAA • Un mécanisme de dégradation: • La monoamine oxydase MAO Recapture 5-HT 5-HT R. SERT 5-HT 5-HT Na+ R. canaux (5-HT3) R. à 7 domaines transmembranaires Na+ Signalisation intracellulaire Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation VMAT

8. Tryptophane hydroxylase • neurones myentériques • cellules entérochromaffines Mélatonine • glande pinéale Les acteurs du système 5-HT3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH • Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT tryptophane • noyaux du raphé 5-hydroxytryptophane 5-HTP Décarboxylase des aa aromatiques 5-hydroxytryptamine SÉROTONINE

9. locus Tph endogène Vecteur de ciblage locus Tph muté • Les souris Tph-/-(+/-)sont viables ♂ Tph1+/- x ♀ Tph1+/- Inactivation du gène Tph chez la souris • Stratégie de « knock-in »

10. glande pinéale • Effondrement du taux de 5-HT. • neurones myentériques • cellules entérochromaffines 2 gènes Tph • Taux de 5-HT normal. Tph2 • noyaux du raphé Deux gènes Tph… *** ***

11. 65% d’identité TPH1 5 2 4 6 7 8 9 10 11 3 TPH2 1 2 5 4 6 7 8 9 10 11 3 Domaine de régulation et d’interaction Domaine catalytique 83% d’identité Région 3’ non traduite 90% Glande pinéale Cellules entérochromaffines TPH1 non neuronale 5% • Biosynthèse de 5-HT 5% Neurones 5-HT du raphé Neurones myentériques TPH2 neuronale Souris invalidées pour le gène Tph1 Lieux d’expression des gènes Tph

12. Tph1 E14.5 Tph2 E10.5 E12.5 Tph2 NM CE Tph1 E15.5 Sérotonine de l’embryon Temps d’expression des gènes Tph 16.5 0.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 18.5 2.5 Naissance • glande pinéale • SNC • intestins

13. 50% Tph1+/- *** 3-15% Tph1-/-(+/-) *** *** 15% 3% En résumé … parents Souris viables 100% de survie adultes

14. 3-15% Tph1-/-(+/-) Faible taux de 5-HT circulante Problèmes cardiaques dysfonctionnement? Conséquences du faible taux de 5-HT circulante?

15. Pression Insuffisance cardiaque Volume La cathéterisation de conductance Courbe de fonction ventriculaire gauche = contractilité Pression éjection contraction relaxation remplissage Volume

16. 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1-/- • Phase de décompensation Souris 296 Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1+/+ Tph1-/- • Phase de compensation Souris 273

17. 3-15% Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1-/-(+/-) n=7 n=7 n=30 n=30

18. 50% Tph1+/- 3-15% Tph1-/-(+/-) Conclusion (1) parents Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Souris viables 100% de survie adultes Hétérogénéité importante

19. 3-15% Tph1-/-(+/-) Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque? • Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? • exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress • Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque?

20. 3-15% Tph1-/-(+/-) Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie? • Protocoles envisageables: • Exercice physique (marche forcée, nage). • Une stimulation adrénergique. • Protocole expérimental choisi: • Test pharmacologique d’effort avec la dobutamine. Inotrope + ( force de contraction) Bathmotrope + ( conduction) Chronotrope + ( fréquence) Catécholamine de synthèse Agoniste 1-adrénergique dobutamine

21. 3-15% Tph1-/-(+/-) Survie moyenne des souris Tph1-/-(+/-) après dobutamine: 11.4 ± 2.8 min. Survie (min) non sensibles sensibles Souris Tph1-/-(+/-) Souris contrôles Aucune réserve contractile cardiaque… Souris Tph1-/- Non sensibles Souris Tph1-/- sensibles

22. 3-15% Tph1-/-(+/-) • Étude de liaison des récepteurs5-HT cardiaques x 2 néoexpression Modification de la signalisation 5-HT cardiaque • Étude de liaison des récepteurs-adrénergiques cardiaques Ø modification de la signalisation -AR.

23. 50% Tph1+/- 3-15% Tph1-/-(+/-) Conclusion (2) parents Absence de réserve contractile cardiaque Souris viables 100% de survie stress, facteur aggravant de la cardiopathie adultes 5-HT2B SERT Hétérogénéité importante • Diminution contractilité cardiaque • Insuffisance cardiaque

24. 3-15% Tph1-/-(+/-) Analyse des souris Tph1-/- issues de mères Tph1-/-. Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie? • Protocole expérimental: • Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. • Détermination des taux individuels de sérotonine circulante. • Contrainte: • Analyser un nombre important d’animaux . • Générer un nombre important d’animaux mutés dans une même portée • Diminuer l’hétérogénéité entre les individus d’une même portée.

25. 50% Tph1+/- 3-15% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) Tph1-/-(-/-) Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! parents Souris viables Très peu de naissance 100% de survie adultes 5-HT2B SERT 20% de survie • Diminution contractilité cardiaque • Insuffisance cardiaque • Stress aggrave la cardiopathie

26. Tph1-/-(-/-) Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle? Embryons normaux malformations létales à ~E12 Tph1+/+(+/-) Tph1+/-(-/-) Tph1+/+(+/+) Tph1-/-(-/-) La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal.

27. ?? 50% Tph1+/- 3-15% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) Tph1-/-(-/-) Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! parents Souris viables Très peu de naissance 100% de survie adultes ?? 5-HT2B SERT 20% de survie • Diminution contractilité cardiaque • Insuffisance cardiaque • Stress aggrave la cardiopathie

28. ?? Tph1-/-(-/-) • Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois. Quel phénotype cardiaque? • Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques. • Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). • Se développe entre 2 et 5 mois.

29. ?? 2 mois Tph1-/-(-/-) 5 mois FS (%) FC (bpm) Quel phénotype cardiaque? • Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles. • Signes fonctionnels de CMD: •  FS (index de contractilité)

30. ?? BNP (pg/ml) Tph1-/-(-/-) • Augmentation plus importante chez les Tph1-/-(-/-). Quel phénotype cardiaque? • Mesure des marqueurs plasmatiques précoces d’insuffisance cardiaque. 5 mois Troponine Ic (ng/ml) CK-MB (µg/l) • Augmentation des marqueurs précoces d’IC chez les Tph1-/-(+/-) Les souris Tph1-/-(+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé Influence du génotype maternel

31. 50% Tph1+/- 3-15% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) Conclusion (3) parents Souris viables Très peu de naissance 100% de survie 20% de survie adultes ?? 5-HT2B SERT Cardiopathie dilatée Augmentation +++ des marqueurs d’IC • Diminution contractilité cardiaque • Insuffisance cardiaque • Stress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC

32. La sérotonine circulante • 90% de la sérotonine circulante est synthétisée dans les cellules entérochromaffines par la TPH1. Neurones myentériques (TPH2)  99% plaquettes sanguines Cellules entérochromaffines (TPH1) 5-HT  1% plasma

33. ?? • Même taux de 5-HT entre les souris Tph1-/-(+/-) et Tph1-/-(-/-). 5-HT sang total (µM) Tph1-/-(-/-) Taux de sérotonine plaquettaire? • > 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines. 5 mois Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire.

34. ?? • Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre lesTph1-/-(+/-) et -/-(-/-). 5-HT plasma (nM) Tph1-/-(-/-) Taux de sérotonine plasmatique? • < 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin. 5 mois

35. ?? Tph1-/-(-/-) La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin. BNP 5-HT plasma Corrélation 5-HT / cardiopathie? corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.

36. 50% Tph1+/- 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique Conclusion (4) parents Souris viables Très peu de naissance 100% de survie 20% de survie 3-15% 20% 3-15% 41% adultes 5-HT2B corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. SERT Tph1-/-(+/-) • Diminution contractilité cardiaque • Insuffisance cardiaque • Stress aggrave la cardiopathie • Augmentation ± des marqueurs d’IC • Cardiopathie dilatée • Augmentation +++ des marqueurs d’IC

37. Tph1 E14.5 Tph2 E10.5 Tph2 E12.5 Tph1 E15.5 5-HT2B SERT Sérotonine maternelle Sérotonine de l’embryon Le génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? 0.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5 2.5 Naissance

38. Tph1-/-(-/-) La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique? • diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1-/-(-/-)? • augmentation du catabolisme de la 5-HT? Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1-/-. • modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes?

39. Tph1-/-(-/-) La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines 20% Les plaquettes sanguines • Nombre de plaquettes sanguines. 5 mois • Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel . Plaquettes (103/µl)

40. Sérotonine … une première piste? • Plaquettes sanguines 5-HT2A? 5-HT2B? SERT 5-HT2B SERT 5-HT2A SERT Réarrangement du cytosquelette Réarrangement du cytosquelette 5-HT mégacaryocytes proplaquettes plaquettes

41. Maintien du phénotype 5-HT foetal  contractilité cardiomyocytes Formation anormale du cytosquelette  activation petites protéines G (RhoA?) Réarrangement anormal du cytosquelette  maturation Mégacaryocytes / proplaquettes L’implication des petites protéines G? • cardiomyocytes adultes SERT x 5 5-HT2Bx 2 5-HT 5-HT 5-HT2B SERT • mégacaryocytes

42. sérotonine maternelle Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite… Études épidémiologiques Environnement maternel