TISSUE ENGINEERING COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI SU SUPPORTO DI PLASMA

1. UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche TISSUE ENGINEERINGCOLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI SU SUPPORTO DI PLASMA Relatori Chiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola Correlatori Chiar. mo Dott. Stefano Negri Laureanda Elena Alessi Anno Accademico 2007/2008

2. TISSUE ENGINEERING Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo PRINCIPI Prelevare le cellule staminali del Paziente Far crescere e differenziare le cellule su un supporto biologico Sottoporre il Paziente al trapianto

3. BIOMATERIALI devono possedere le seguenti caratteristiche: • tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti (biocompatibili) • impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario (biodegradabili) • contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite

4. LE MATRICI PIU’ IDONEE.. Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si suddividono in: - collagene - agarosio - acido ialuronico - colla di fibrina - cellulosa Grande interesse è rivolto verso l’utilizzo del plasma umano come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti

5. SCOPO TESI Isolare cheratinociti e fibroblasti umani, utilizzando il plasma autologo per formare lembi di cute con caratteristiche morfo-funzionali e immunoistochimiche simili all’epidermide normale

6. CASO CLINICO V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa circonferenziale alla gamba sinistra.

7. MATERIALI E METODI • Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti umani autologhi, prelevati da un’unica biopsia • Preparazione del supporto di plasma • Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità

8. PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA ACIDO TRANEXAMICO PLASMA SOLUZIONE FISIOLOGICA CLORURO DI CALCIO + FIBROBLASTI + CHERATINOCITI 30’, 37°C, 5% CO2

10. CONSISTENZA DEL SUPPORTO

11. DENSITA’ DI SEMINA 5X104/cm2 FU 5X104/cm2 KE 5X104/cm2 FU 10X104/cm2 KE 5X104/cm2 FU 15X104/cm2 KE 10X104/cm2 FU 5X104/cm2 KE 10X104/cm2 FU 10X104/cm2 KE 10X104/cm2 FU 15X104/cm2 KE 15X104/cm2 FU 5X104/cm2 KE 15X104/cm2 FU 10X104/cm2 KE 15X104/cm2 FU 15X104/cm2 KE

12. MODALITA’ DI SEMINA

13. PRELIEVO 4 giorni 8 giorni 13 giorni • i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per: • Valutazione della consistenza ottimale • Valutazione della densità cellulare ottimale • Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche

14. COLTURA PRIMARIA cheratinociti fibroblasti 3T3 microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X)

15. COLTURA SECONDARIA cheratinociti cheratinociti fibroblasti cheratinociti cheratinociti cheratinociti microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X)

16. FIBROBLASTI Derma Fibroblasti microscopio a contrasto di fase (400X)

17. FIBROBLASTI microscopio a contrasto di fase (400X)

18. FIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X)

19. fibroblasti cheratinociti microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)

20. FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE Ematossilina-Eosina (400X)

21. FIBROBLASTI Ematossilina-Eosina (400X)

22. CHERATINOCITI Ematossilina-Eosina (400X)

23. FIBROBLASTI immunoistochimica: vimentina (400X)

24. CHERATINOCITI immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)

25. MEMBRANA BASALE immunoistochimica: collageno IV

26. immunoistochimica: Mib1

27. APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE

28. INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE prima...

29. INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE ..dopo

30. CONCLUSIONI