SPEKTROSKOPIA NMR PODEJŚCIE PRAKTYCZNE

1. SPEKTROSKOPIA NMRPODEJŚCIEPRAKTYCZNE CZĘŚĆ:IV mgr inż. TOMASZ LASKOWSKI

2. CZĘŚĆ CZWARTAVARIETAS DELECTAT

3. PROLOGOS:ODSPRZĘGANIE SPINÓW(DECOUPLING)

4. ODSPRZĘGANIE SPINÓW • Eliminacja zjawiska sprzężenia spinowo-spinowego występującego pomiędzy wybranym protonem a jego sąsiadami poprzez selektywne naświetlanie tego protonu. • Naświetlanie– napromieniowywanie próbki falą elektromagnetyczną o częstotliwości rezonansowej wybranego protonu przed rejestracją widma. • W efekcie: • sygnał rezonansowy protonu naświetlonego nie pojawia się w widmie; • w multipletowości dotychczasowych partnerów sprzężenia naświetlonego protonu nie jest zawarta informacja o sprzężeniu z naświetlonym protonem.

5. ODSPRZĘGANIE SPINÓW A C A D B D C B B D C

6. ODSPRZĘGANIE SPINÓW A C A D B D C B A C D

7. ODSPRZĘGANIE SPINÓW A C A D B D C B A D B

8. ODSPRZĘGANIE SPINÓW A C A D B D C B A C B

9. ODSPRZĘGANIE SPINÓW • ZALETY • Decoupling zwalnia z obowiązku określania multipletowości wszystkich sygnałów rezonansowych. • Ustalanie sekwencji sprzężeń nie wymaga pomiarów stałych sprzężenia. • WADY • Ustalenie sekwencji sprzężeń wymaga przeprowadzenia kilku eksperymentów. • Może zostać przeprowadzone jedynie na protonach znacznie różniących się przesunięciem chemicznym.

10. EPEISODION I:SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIAHOMOJĄDROWE w 2DCOSY– CORRELATED SPECTROSCOPYTOCSY – TOTAL CORRELATED SPECTROSCOPY

11. COSY widmo 1H diagonala sygnał autokorelacyjny sygnał korelacyjny (crosspeak) oś wtórna (F1) oś pierwotna (F2)

12. C A D B COSY A D C B A B,A C D A,B B

13. B,C C A D B COSY A D C B A B,A C D A,B B C,B

14. B,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A C D A,B B C,B D,B

15. D,C B,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A C D C,D A,B B C,B D,B

16. D,C B,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A C D C,D A,B B C,B D,B

17. COSY

18. D,C B,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A C D C,D A,B B C,B D,B

19. D,C B,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A • NIEPRAWIDŁOWA • OBRÓBKA WIDMA C D C,D A,B B C,B D,B

20. C,A D,A B,C D,C C A B,D D B COSY A D C B A B,A • INNY • WARIANT OBRÓBKI C D C,D A,B B C,B D,B

21. COSY • ZALETY • Bardzo mała różnica przesunięć chemicznych (nakładanie się) sygnałów rezonansowych oraz ich nieczytelna multipletowość nie przeszkadzają (za bardzo)w interpretacji wyników. • Do ustalenia sekwencji sprzężeń w danym układzie spinowym wystarcza przeprowadzenie jednego eksperymentu. • Stosunkowo łatwe (choć nie zawsze) w wykonaniu, obróbce i interpretacji. • WADY • Interpretacja skomplikowanych widm COSY drastycznie zwiększa zapotrzebowanie mózgu na glukozę. • Niewielka rozdzielczość widm COSY – konieczność stosowania odmian eksperymentu COSY (np. DQF-COSY) do badania bardziej złożonych układów.

22. COSY

23. TOCSY

24. TOCSY • ZALETY • Duża ilość sygnałów korelacyjnych. • Możliwość szybkiego określenia przynależności protonów do poszczególnych układów spinowych. • Możliwość rozpoznania struktury układów spinowych na podstawie ilości sygnałów korelacyjnych bądź obecności sygnałów rezonansowych protonów charakterystycznych. • WADY • Duża ilość sygnałów korelacyjnych.

25. COSY protony amidowe: 7-8 [ppm]; sprzężenie skalarne z α

26. TOCSY protony amidowe: 7-8 [ppm]; sprzężenie skalarne z α

27. STASIMON I: SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA HETEROJĄDROWE

28. SPRZĘŻENIE1H-19F -CH3 -CH2- 2JH,F= 40-50 Hz H H 4JH,F= 4-5 Hz

29. 0,5 % 0,5 % SPRZĘŻENIE1H-13C H 3JH,H 99 % dublet 1JH,C dublet dubletów 1 % 1JH,C widmo 1H NMR: 1H 1H linie satelitarne (sidebands) 1H 1H 12C 13C 12C 12C 1JH,C= 115-270 Hz 99 % δ [ppm]

30. SPEKTROSKOPIA13C NMR • 1H DECOUPLING; SPRZĘŻENIE 13C-1H PRZEZ JEDNO WIĄZANIE 1JC,H= 110-320 Hz

31. SPEKTROSKOPIA13C NMR • SPRZĘŻENIE 13C-1H PRZEZ WIELE WIĄZAŃ 2,3JC,H= 0-60 Hz

32. SPEKTROSKOPIA13C NMR • DEPT (DISTORIONLESS ENHANCEMENT BY POLARIZATION TRANSFER) CH3 CH2 CH CHX C

33. SPEKTROSKOPIA13C NMR

34. SPRZĘŻENIE13C-19F (CIEKAWOSTKA!) • WIDMO 13C NMR, 1H-DECOUPLING, BRAK 19F-DECOUPLING -CH3 -CH2- C=O

35. EPEISODION II:SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIAHETEROJĄDROWE w 2DHSQC– HETERONUCLEAR SINGLE-QUANTUM COHERENCEHMBC – HETERONUCLEAR MULTIPLE BOND CORRELATION

36. HSQC

37. HSQC

38. HMBC H3’,C1’ H1’,C3’ H1,C2’

39. 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC • ZALETY I ZASTOSOWANIE • 1H-13C HSQC – pomocne przy rekonstrukcji izolowanych układów spinowych jąder 1H (bezlitośnie wskazuje diastereotopowe grupy –CH2–). • 1H-13C HSQC – pozwala na pełne przyporządkowanie sygnałów rezonansowych w widmie 13C NMR. • 1H-13C HMBC – pozwala na płynne poruszanie się pomiędzy izolowanymi układami spinowymijąder 1H. • WADY • 1H-13C HMBC – nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne pojawiają się w widmie. ICH BRAK NIE JEST DOWODEM NA NIEPOPRAWNOŚĆ ZAŁOŻONEJ STRUKTURY!

40. STASIMON II:DIPOLARNE SPRZĘŻENIAHOMOJĄDROWENOE– NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT

41. NOE Jądrowy efekt Overhausera –zjawisko wzmocnienia (bądź osłabienia) sygnału rezonansowego protonu, który znajduje się bliskow przestrzeniprotonu naświetlanego. H C NOE hv H H δ [ppm] δ [ppm] NOE Zasięg efektu Overhausera: ok. 4 Å. Jego wystąpienie jest dowodem bliskości jąder w przestrzeni.

42. NOE NOE NOE

43. EPEISODION III:DIPOLARNE SPRZĘŻENIAHOMOJĄDROWE w 2DNOESY– NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT SPECTROSCOPY ROESY – ROTATING-FRAME OVERHAUSER EFFECT SPECTROSCOPY

44. NOESY/ROESY 17 20b

45. NOESY/ROESY • ZASTOSOWANIE • Eksperymenty bardzo użyteczne przy analizie konformacyjnej. • Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy – konfiguracji absolutnej. NOE NOE

46. NOESY/ROESY • ZASTOSOWANIE • Eksperymenty bardzo użyteczne przy analizie konformacyjnej. • Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy – konfiguracji absolutnej. • Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także – sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych. NOE

47. NOESY/ROESY • ZASTOSOWANIE • Eksperymenty bardzo użyteczne przy analizie konformacyjnej. • Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy – konfiguracji absolutnej. • Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także – sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych. • WADY • Nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne pojawiają się w widmie. ICH BRAK NIE JEST DOWODEM BRAKU BLISKOŚCI JĄDER ATOMOWYCH W PRZESTRZENI!

48. STASIMON III:ZESTAWIENIE WIDM 2D

49. ZESTAWIENIEWIDM 2D * skalarne = spinowo-spinowe; ** dipolarne = przez przestrzeń.

50. EKSODOS:ZAWIJANIE SYGNAŁÓW