Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica

1. Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI Tesi di Laurea di: Serena Diana Ghezzi

2. Sclerosi Laterale Amiotrofica La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento dell’esordio dei sintomi è in media di 3-5 anni con un decorso più rapido nelle forme ad esordio bulbare. INTRODUZIONE L’exitus avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura respiratoria La diagnosi è essenzialmente clinica, non esiste infatti un test diagnostico specifico. 5-10% familiari (SLAf) 90-95% sporadici (SLAs) Dati familiari ed epidemiologici indicano che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi.

3. TARDBP La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1 INTRODUZIONE Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 è iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma innescando la degenerazione motoneuronale

4. TARDBP (TDP43) INTRODUZIONE ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 ex1 1p36 GRR NLS RRM1 RRM2 414 aa, 43 KDa segnale di localizzazione nucleare siti di interazione con l’mRNA sito di interazione hnRNP Sito di clivaggio (aa216-219) Sito di clivaggio (aa86-89) regolazione della trascrizione regolazione dello splicing stabilità dell’mRNA

5. OBIETTIVI Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare geneticamente l’ampia coorte di pazienti SLA afferenti all’Ambulatorio Malattie del Motoneurone – Dipartimento di Scienze Neurologiche – Policlinico di Milano. SCOPO Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione A382T risultata essere la variante più comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellulare che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale mutazione.

6. SCREENING GENETICO RISULTATI 4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici) La frequenza mutazionale è risultata pertanto essere del 2.3% calcolata sull’intera coorte di pazienti (1.6% nelle forme sporadiche e 7.7% in quelle familiari).

7. I:1 I:2 II:2 II:3 II:4 II:1 III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 IV:1 IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10 V:1 V:2 V:3 V:4 V:5 V:6 V:7 V:8 V:9 VI:2 VI:3 VI:5 VI:6 VI:7 VI:8 VI:1 VI:4 p.Ala382Thr I:2 I:1 II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8 III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9 IV:2 IV:3 IV:1 SCREENING GENETICO RISULTATI SLAf SLAs c.881G>T p.Gly294Val c.1144G>A p.Ala382Thr c.883G>A p.Gly295Ser p.Gly348Cys G348C A382T G294V G295S

8. SCREENING GENETICO RISULTATI ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 ex1 c.881G>T p.Gly294Val c.1144G>A p.Ala382Thr c.883G>A p.Gly295Ser GRR NLS RRM1 RRM2 p.Ala382Thr p.Gly348Cys

9. Costruzione del modello cellulare 820bp 820bp 965bp A B 521bp RISULTATI NdeI B A c.1144G>A p.Ala382Thr ficol mRNA cDNA

10. Validazione del modello cellulare hHEK hSK-N-SH mES Western-Blot NT NT WT WT A382T A382T NT WT A382T 45 KDa 45 KDa RISULTATI 45 KDa actina TDP43 DAPI MERGE Immunocitochimica hHEK NT hSK-N-SH WT A382T mES

11. Validazione del modello cellulare GAPDH TDP43 RISULTATI

12. Costruzione del modello con GFP hHEK TDP43WTGFP DAPI TDP43 MERGE wt TDP43A382TGFP A382T RISULTATI

13. CONCLUSIONI GENETICA Il quadro clinico della SLA10 è analogo a quello della malattia classica, con qualche variabilità interfamiliare per quanto riguarda età e sito di esordio DISCUSSIONE La frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra coorte di paziente è risultata pari al: 1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%). E’ interessante notare come, per quanto riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1, nel nostro come in altri studi.

14. CONCLUSIONI mES ANALISI FUNZIONALE NT WT A382T NT WT A382T Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. NT WT A382T 45 KDa hHEK hSK-N-SH 45 KDa 45 KDa actina DISCUSSIONE

15. 1 1 1 2 2 2 3 3 3 CONCLUSIONI ANALISI FUNZIONALE Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. HEK non trasfettate HEK TDP43WT HEK TDP43A382T 45 KDa 45 KDa 45 KDa mRNA non tradotto proteina degradata DISCUSSIONE

16. PROSPETTIVE • Proseguire la caratterizzazione genetica • Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione proteica • Verificare l’eventuale regolazione dei livelli di trascritto • Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli esprimenti la proteina legata alla GFP • Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un modello neuronale (es. SK-N-SH) • Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari fin qui descritti DISCUSSIONE

17. RINGRAZIAMENTI