Review ENZIM PEKTIN LIASE EC 4.2.2.10 OLEH : ROBBY ZIDNY & BIBIT

1. Review ENZIM PEKTIN LIASE EC 4.2.2.10 OLEH : ROBBY ZIDNY & BIBIT

2. Pektin • Pektin Liase • Mekanisme Katalisis Reaksi • Sumber enzim • Struktur • Nilai parameter kinetika • Pemurnian & Isolasi • Genetika molekuler enzim • Aplikasi di industri

3. PEKTIN • Pektin berasal dari bahasa yunani pektikos yang berarti kental. • Pektin merupakan polimer asam D-galakturonat dengan ikatan α-1,4-glikosidik dan rantai samping yang terdiri dar rhamnosa, arabinosa, galaktosa, dan xilosa.

4. PEKTIN

5. SUMBER PEKTIN • Pektin banyak ditemukan pada dinding sel primer dan lamela tengah antar sel tanaman tingkat tinggi. • Sumber utama pektin adalah kulit buah jeruk-jerukan. • Sumber pektin lain misalnya, apel, jambu biji, quince, plum, gooseberri, jeruk. • Pektin dalam jumlah kecil juga dapat ditemukan pada ceri, anggur, dan strawberi.

6. PEKTIN LIASE • Pektin liase merupakan salah satu enzim golongan pektinase yang mampu mendegradasi molekul pektin yang banyak ditemukan pada sel tanaman. • Pektin liase dapat memotong pektin secara langsung dengan mekanisme β-eliminasi yang menghasilkan 4,5-unsaturated oligogalakturonida.

7. MEKANISME REAKSI Pektin liase mengkatalisis reaksi depolimerisasi pektin secara langsung dengan memotong ikatan glikosidik internal melalui mekanisme transeliminasi sementara subkelas enzim pektinase yang lain secara sekuensial mendegradasi molekul pektin melalui mekanisme hidrolisis.

8. SUMBER PEKTIN LIASE • Sumber utama pektin liase berasal dari jamur Aspergillus, Penicillium, Fusarium. Sumber lainnya adalah bakteri dan ragi.

9. STRUKTUR MAKROMOLEKUL PEKTIN LIASE • Kristal struktur pektin liase A (PNLA) dari dua strain Aspergillus niger, N400 dan 4M-147 mengungkapkan bahwa PNLA memiliki folding ß-sheet paralel dan berbagi banyak fitur struktural dengan pektat liase meskipun tidak lebih dari 17% sekuens setelah dilakukan structure-based alignment • Sisi pengikatan substrat PNLB terdiri dari jaringan luas Trp yang sangat lestari dan His residu, sementara PNLA menunjukkan celah yang didominasi oleh residu aromatik yang terdiri dari empat tryptophan (Trp 66, Trp 81, Trp 151 dan 212 Trp), tiga tyrosin (Tyr 85, 211 dan Tyr Tyr 215) dan asam amino bermuatan seperti Asp 154, 176 dan Arg Arg 236 yang diharapkan memainkan peran sebagai katalisator. Gambar 3.(A) struktur keseluruhan pektin lyase A dari strain 4M-147. Skema tersebut merepresentasi di mana panah mewakili ß-strand dan koil merepresentasikan heliks. Paralel ß-sheet 1 (PB1) ditunjukkan dengan warna kuning, PB2 adalah hijau dan PB3 adalah merah. Antiparalel ß-sheet dalam loop panjang T3 diperlihatkan dengan warna biru [53]. (B) Skema diagram pita backbone pektin lyase B, menggambarkan struktur sekunder. Heliks direpresentasikan oleh koil merah muda dan struktur ß ditunjukkan oleh panah. ß-Sheet paralel, PB1, berwarna kuning, PB2 adalah biru, dan PB3 merah. Struktur ß-Sheet antiparalel dalam turn T3 pertama dan ß-strand pendek dalam loop T3 ketiga ditunjukkan dalam oranye. Ikatan disulfida yang ditunjuk oleh tebal, garis hitam

10. NILAI PARAMETER KINETIKA Berikut ini merupakan parameter kinetic dari enzim pectin liase yang diambil dari database enzim BRENDA

11. NILAI PARAMETER KINETIKA

12. ISOLASI & PEMURNIAN • Pektin liase dapat diisolasi dari filtrat kultur jamur, bakteri, atau ragi. Pektin liase pertama kali dimurnikan dari pektinol R-10 dengan prosedur pemurnian sederhana menggunakan kromatografi kolom DEAE-cellulose dan sephadhex G-75 dan G-50. • Pektin liase dari Penicillium italicum dapat dimurnikan dengan kromatografi DEAE-cellulose, kromatografi CM-cellulose, kromatografi phenyl sepharose CL-4B, dan kromatografi phenyl sepharose. • Pektin liase yang memiliki homogenitas mirip dapat dimurnikan dengan fraksi amonium sulfat, kromatografi kolom CM-sepharose, dan elektrofokusing preparatif. • Bakterial pektin liase yang diproduksi oleh Pseudomonas flourescens W-51 dapat dimurnikan dengan kromatografi penukar ion, kolom metil-agaros column diikuti dengan kromatografi interaksi hidrofobik menggunakan kolom fenil separos CL 48.

13. GENETIKA MOLEKULER PEKTIN LIASE 1. Studi genetika pectin liase • Studi delesi promotor telah mengungkapkan adanya sekuens lestari di pectinases seperti 50-TYATTGGTGGAA-3 (sering di PG) yang terlibat dalam aktivasi ekspresi gen dan juga CCCTGA diidentifikasi di Aspergillus niger. • Urutan nukleotida dan situs awal transkripsi dari pnlA, gen struktural untuk PNL strain 71, telah ditentukan. Tidak adanya urutan mirip dengan protein konsensus catabolite activating protein (CAP)-binding site dan Lexa-binding siteEscherichia coli adalah konsisten dengan pengamatan bahwa promotor pnlA tidak rentan terhadap represi katabolit, dan ekspresi pnlA tidak terpengaruh secara substansial dalam E. coli mutan-LexA. • Promotor pnlA diperkirakan terdiri dari 10 daerah (TACAAT) mirip dengan urutan promotor E. coli S70 (TATAAT). Sebaliknya, 35 Wilayah yang sesuai (TAAGCG) dipisahkan oleh 17 bp spacer, berbagi sedikit kesamaan dengan urutan konsensus E. coli

14. GENETIKA MOLEKULER PEKTIN LIASE 1. Studi ekspresi gen pectin liase • Sebelumnya telah dilaporkan bahwa produksi PNLs bakteri tergantung pada kondisi pertumbuhan, serta faktor-faktor lain yang menghambat biosintesis DNA tersebutseperti adanya DNA-damaging agentmitomycin, asam nalidiksat atau sinar UV. Induksi ini disebabkan oleh aktivasi RecA yang menstimulasi autodegradasi dari LexA, sebuah supressor dari kebanyakan operon dalam SOS-box. • Overproduksi PNL dalam E. coli BL21 (DE3) dicapai dengan menggunakan sistem pET. Gen PNL disisipkan ke dalam plasmid pET29c setelah amplifikasi PCR, menggunakan plasmid pPNL6301 sebagai template. Enzim hasil overproduksi yang membawa enam His tag dimurnikan dekat dengan homogenitasnya dengan kromatografi afinitas pada Ni2 + nitrilotriacetate (Ni2+-NTA)- kolom agarosa. Suatu protein inhibitor labil panas PNL dengan massa molekul 24 kDa diidentifikasi juga.

15. PEMANFAATAN DI BIDANG INDUSTRI • Pektin liase banyak dimanfaatkan dalam industri pembuatan jus buah karena pektin liase dapat memotong rantai pektin tanpa menggannggu gugus ester yang memberikan aroma yang khas pada jus. Selain itu, pektin liase tidak menghasilkan produk alkohol yang beracun. • Selain itu pektin liase juga dimanfaatkan dalam industri proses pembuatan wine.

16. DAFTAR PUSTAKA Yadaav et.al, (2009). Pectin Lyase: A review. Elsivier, 44, 1–10. Papi R dan Kyriakidis D, (2003). Overexpression of the pectin lyase gene of Pseudomonas marginalis in Escherichia coli and purification of the active enzyme. Biotechnol. Appl. Biochem. 37, 187–194. Linhardt et.al, (1985). Polysaccharide Lyases. Applied Biochemistry and Biotechnology. 12, 135-140. Torres et.al, (2003). Identification of amino acid residues critical for catalysis and stability in Aspergillus niger family 1 pectin lyase A. 370, 331±337 Sieiro et.al, (2012). Microbial Pectic Enzymes in the Food and Wine Industry, Food Industrial Processes - Methods and Equipment, Dr. Benjamin Valdez (Ed.), ISBN: 978-953-307-905-9, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/food-industrial-processes-methods-and-equipment/microbial-pecticenzymes- in-the-food-and-wine-industry