Estrongiloidiasis Serolog a en la Amazonia Peruana

1. Estrongiloidiasis Serolog�a en la Amazonia Peruana Pablo Pe�ataro Yori, RN. MPH Laboratorio sat�lite IQTLAB Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health iqtlab@jhsph.edu Iquitos 7 de Octubre de 2006

2. Yori PP, Kosek M, Gilman RH, C�rdova J, Berd C, Ch�vez CB, Olortegui MP, Montalvan C, Sanchez GM, Worthen B, Worthen J, Leung F, Ore CV. A stool and serosurvey for Strongyloides stercoralis was conducted in a community in the Peruvian Amazon region. Strongyloidiasis stercoralis was identified in the stool of 69 (8.7%) of 792 participants. Six hundred nine sera were tested using by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which had a sensitivity of 92% and a specificity of 94%; 442 (72%) were positive. In multivariable logistic regression models, having S. stercoralis in stool was associated with hookworm in the same specimen (odds ratio [OR] = 4.44, 95% confidence interval [CI] = 2.02-9.79), occasionally or never wearing shoes (OR = 1.89, 95% CI = 1.10-3.27), and increasing age (OR = 1.012 for each one-year increase, 95% CI = 1.00-1.03). Similarly, occasionally or never wearing shoes (OR = 1.54, 95% CI = 1.01-2.37) and increasing age (OR = 1.04 for each one-year increase, 95% CI = 1.02-1.06) were associated with an increased risk of a positive S. stercoralis ELISA result. The ELISA had a negative predictive value of 98%and is an excellent screening test for strongyloidiasis.

3. Strongyloides stercoralis

4. Descripci�n Importante pat�geno humano. Helmintiasis del duodeno y la porci�n superior del yeyuno, a menudo asintom�tica. Distribuci�n mundial. 100 y 200 millones de personas infestadas

5. Descripci�n HTLV-1 (? carga parasitaria / diseminaci�n, HIV aumenta la carga parasitaria no incrementa el riesgo de estrongiloidiasis diseminada), desnutrici�n infantil (? carga parasitaria) Los tratamiento con esteroides (incluso por periodos cortos) se han asociado con ?? del riesgo de estrongiloidiasis diseminada (frecuentemente mortal) Dif�cil diagn�stico: Las larvas son expulsadas intermitente, requiere t�cnicas espec�ficas que generalmente no son realizadas en los ex�menes parasitarios de rutina.

6. Descripci�n - Transmisi�n y ciclo de vida CARACTER�STICAMENTE: potencial para autoinfectar y multiplicarse dentro del hospedador. Por lo tanto Las infestaciones puedes durar por >30 a�os. La intensidad de la infecci�n no esta determinada por la carga infestante inicial. Deficiencias en el saneamiento favorecen la transmisi�n. capillariasiscapillariasis

8. Descripci�n - S�ndromes cl�nicos

10. Material y m�todos Poblaci�n de estudio Estudio de heces ELISA para S. Stercoralis ELISA para filarias An�lisis de los datos Poblaci�n de estudio. Este trabajo fue realizado en su fase de campo entre los meses de agosto y diciembre de 2002 en el poblado de Santo Tom�s de Iquitos. Comunidad situada a 11 Km. de la ciudad de Iquitos en el departamento de Loreto, Per�. Se realiz� un censo de la poblaci�n, y se recogi� informaci�n sobre frecuencia en el uso de zapatos, ocupaci�n, consumo de agua y eliminaci�n de excretas. Los participantes fueron reclutados voluntariamente entre el conjunto de la poblaci�n censada. A cada persona se le explic� verbalmente los detalles del estudio y se les invit� a participar mediante la firma de un documento de consentimiento informado. La participaci�n consist�a en entregar una muestra de heces y una extracci�n de 5 ml sangre mediante punci�n venosa. Este estudio cuenta con la aprobaci�n del Comit� de �tica de la Asociaci�n Ben�fica Prisma y del Comit� de �tica de la Universidad de Johns Hopkins respectivamente as� como las autoridades locales. Las muestras de heces fueron analizadas por el m�todo de observaci�n directa, sedimentaci�n de Baermann modificado, y m�todo de sedimentaci�n en copa el mismo d�a de ser recolectadas, una porci�n de 5 mg fue separada. Sobre 515 muestras de heces se realiz� adicionalmente un cultivo en agar plato. Las muestras de sangre fueron centrifugadas y el suero separado y conservado a � 20 C hasta su posterior estudio mediante ELISA que fue realizado entre octubre de 2003 y marzo de 2004. Previamente se hizo un hematocrito. Para determinar posibles reacciones cruzadas, 100 sueros tomados al azar de personas de nuestra poblaci�n de estudio fueron enviados al Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta (CDC), GA, donde se les realizo un ELISA indirecto frente Ig G para microfilarias. A cada uno de los participantes se le entr� una ficha con los resultados obtenidos en los estudios parasitol�gicos y hematocrito. A trav�s del Centro de Salud se suministraron las dosis de albendazol recomendadas por la OMS en el caso de haber presentado huevos, quistes o larvas de par�sitos intestinales en la muestra de heces entregada. M�todo de observaci�n directo. Este m�todo fue realizado siguiendo el m�todo est�ndar descrito por la Sociedad Americana de Microbiolog�a (1). M�todo de sedimentaci�n de Baermann modificado. Entre 8 y 10 gramos de heces por muestra fueron depositados en una gasa doble parcialmente sumergida en agua a 40 � C contenida en un tubo c�nico de pl�stico de 50 ml (BD Falcon�). La preparaci�n se dej� reposar 2 horas para que las larvas de S. stercoralis migraran desde las heces al agua purificada por �smosis inversa (Millipore� Elix 10). Mediante una pipeta se extrajo 2 ml del sedimento contenido en el fondo del tubo, 5 gotas de este sedimento fueron depositadas en un portaobjetos y observadas al microscopio bajo la lente de 40 aumentos. M�todo de sedimentaci�n en copa. 15 gramos de heces por muestra fueron tamizados con agua purificada sobre una gasa doble depositada en colador de pl�stico de 6 cm de di�metro y celdas de 1 mm, el producto resultante del tamizado se deposit� en una copa c�nica de 400 ml. Se dej� sedimentar durante 20 minutos a temperatura ambiente (25� C), posteriormente se decant� el agua y se extrajo 2 ml del sedimento con una pipeta. 5 gotas fueron depositadas en un portaobjetos y observadas bajo la lente de 40 aumentos. Cultivo en Agar Plato. Este procedimiento fue realizado siguiendo descripciones previas (2, 2, 5-7, 7). Sobre la superficie del agar con nutrientes dispuesto en una placa de Petri de 90 mm de di�metro se depositaron de 3 a 4 gramos de heces por muestra. Las placas fueron cerradas con su tapa y cultivadas durante 3 d�as a temperatura ambiente (25� C). Posteriormente fueron examinadas mediante una lupa est�reo zum buscando la presencia canales en el agar y larvas. Enzyme-linked inmunosrbent assay Directo IG G Basamos la realizaci�n de esta t�cnica en lo descrito previamente por Carroll, Koga, Neva y Uparanukraw (3, 7, 9, 11). El ant�geno utilizado fue suministrado por el Dr. Franklin A. Neva (Laboratory of Parasitic Diseases, Nacional Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD) que lo obtuvo a partir de larvas filariformes (L3) de S. stercoralis (9). ELISA indirecto frente Ig Gg para microfilarias. Este test fue realizado en los laboratorios del CDC de Atlanta en febrero del 2004. Sobre 100 sueros de la poblaci�n de estudio donde se hab�an identificado larvas de a S. stercoralis por alguna de las pruebas realizadas se realiz� inicialmente un ELISA indirecto utilizando extracto antig�nico de Brugia frente Ig G4, asumi�ndose tambi�n la identificaci�n de una posible infecci�n por Mansonella. Los sueros positivos fueron sometidos adem�s a otro test de ELISA indirecto utilizando ant�geno recombinante frente Brugia Bm14. An�lisis de los datos. Los datos fueron analizados con el programa SPSS versi�n12.0 para Windows (SPSS Inc�). Los valores de corte para la prueba de ELISA, en las tres diluciones con que se trabajaron los sueros, se establecieron a partir de tres desviaciones est�ndar de la media de ABS para el conjunto de los sueros utilizados como control.(sensibilidad del 97 % y 100% de especificidad) La sensibilidad y especificidad de estos puntos se obtuvo mediante una curva ROC .Los valores de P fueron calculados usando el test de chi � cuadrado Los intervalos de confianza al 95% tambi�n fueron calculados en la diferenciaci�n de proporciones. Poblaci�n de estudio. Este trabajo fue realizado en su fase de campo entre los meses de agosto y diciembre de 2002 en el poblado de Santo Tom�s de Iquitos. Comunidad situada a 11 Km. de la ciudad de Iquitos en el departamento de Loreto, Per�. Se realiz� un censo de la poblaci�n, y se recogi� informaci�n sobre frecuencia en el uso de zapatos, ocupaci�n, consumo de agua y eliminaci�n de excretas. Los participantes fueron reclutados voluntariamente entre el conjunto de la poblaci�n censada. A cada persona se le explic� verbalmente los detalles del estudio y se les invit� a participar mediante la firma de un documento de consentimiento informado. La participaci�n consist�a en entregar una muestra de heces y una extracci�n de 5 ml sangre mediante punci�n venosa. Este estudio cuenta con la aprobaci�n del Comit� de �tica de la Asociaci�n Ben�fica Prisma y del Comit� de �tica de la Universidad de Johns Hopkins respectivamente as� como las autoridades locales. Las muestras de heces fueron analizadas por el m�todo de observaci�n directa, sedimentaci�n de Baermann modificado, y m�todo de sedimentaci�n en copa el mismo d�a de ser recolectadas, una porci�n de 5 mg fue separada. Sobre 515 muestras de heces se realiz� adicionalmente un cultivo en agar plato. Las muestras de sangre fueron centrifugadas y el suero separado y conservado a � 20 C hasta su posterior estudio mediante ELISA que fue realizado entre octubre de 2003 y marzo de 2004. Previamente se hizo un hematocrito. Para determinar posibles reacciones cruzadas, 100 sueros tomados al azar de personas de nuestra poblaci�n de estudio fueron enviados al Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta (CDC), GA, donde se les realizo un ELISA indirecto frente Ig G para microfilarias. A cada uno de los participantes se le entr� una ficha con los resultados obtenidos en los estudios parasitol�gicos y hematocrito. A trav�s del Centro de Salud se suministraron las dosis de albendazol recomendadas por la OMS en el caso de haber presentado huevos, quistes o larvas de par�sitos intestinales en la muestra de heces entregada. M�todo de observaci�n directo. Este m�todo fue realizado siguiendo el m�todo est�ndar descrito por la Sociedad Americana de Microbiolog�a (1). M�todo de sedimentaci�n de Baermann modificado. Entre 8 y 10 gramos de heces por muestra fueron depositados en una gasa doble parcialmente sumergida en agua a 40 � C contenida en un tubo c�nico de pl�stico de 50 ml (BD Falcon�). La preparaci�n se dej� reposar 2 horas para que las larvas de S. stercoralis migraran desde las heces al agua purificada por �smosis inversa (Millipore� Elix 10). Mediante una pipeta se extrajo 2 ml del sedimento contenido en el fondo del tubo, 5 gotas de este sedimento fueron depositadas en un portaobjetos y observadas al microscopio bajo la lente de 40 aumentos. M�todo de sedimentaci�n en copa. 15 gramos de heces por muestra fueron tamizados con agua purificada sobre una gasa doble depositada en colador de pl�stico de 6 cm de di�metro y celdas de 1 mm, el producto resultante del tamizado se deposit� en una copa c�nica de 400 ml. Se dej� sedimentar durante 20 minutos a temperatura ambiente (25� C), posteriormente se decant� el agua y se extrajo 2 ml del sedimento con una pipeta. 5 gotas fueron depositadas en un portaobjetos y observadas bajo la lente de 40 aumentos. Cultivo en Agar Plato. Este procedimiento fue realizado siguiendo descripciones previas (2, 2, 5-7, 7). Sobre la superficie del agar con nutrientes dispuesto en una placa de Petri de 90 mm de di�metro se depositaron de 3 a 4 gramos de heces por muestra. Las placas fueron cerradas con su tapa y cultivadas durante 3 d�as a temperatura ambiente (25� C). Posteriormente fueron examinadas mediante una lupa est�reo zum buscando la presencia canales en el agar y larvas. Enzyme-linked inmunosrbent assay Directo IG G Basamos la realizaci�n de esta t�cnica en lo descrito previamente por Carroll, Koga, Neva y Uparanukraw (3, 7, 9, 11). El ant�geno utilizado fue suministrado por el Dr. Franklin A. Neva (Laboratory of Parasitic Diseases, Nacional Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD) que lo obtuvo a partir de larvas filariformes (L3) de S. stercoralis (9). ELISA indirecto frente Ig Gg para microfilarias. Este test fue realizado en los laboratorios del CDC de Atlanta en febrero del 2004. Sobre 100 sueros de la poblaci�n de estudio donde se hab�an identificado larvas de a S. stercoralis por alguna de las pruebas realizadas se realiz� inicialmente un ELISA indirecto utilizando extracto antig�nico de Brugia frente Ig G4, asumi�ndose tambi�n la identificaci�n de una posible infecci�n por Mansonella. Los sueros positivos fueron sometidos adem�s a otro test de ELISA indirecto utilizando ant�geno recombinante frente Brugia Bm14. An�lisis de los datos. Los datos fueron analizados con el programa SPSS versi�n12.0 para Windows (SPSS Inc�). Los valores de corte para la prueba de ELISA, en las tres diluciones con que se trabajaron los sueros, se establecieron a partir de tres desviaciones est�ndar de la media de ABS para el conjunto de los sueros utilizados como control.(sensibilidad del 97 % y 100% de especificidad) La sensibilidad y especificidad de estos puntos se obtuvo mediante una curva ROC .Los valores de P fueron calculados usando el test de chi � cuadrado Los intervalos de confianza al 95% tambi�n fueron calculados en la diferenciaci�n de proporciones.

11. Resultados - Poblaci�n de estudio 1293 individuos en 263 casas 908 individuos enrolados 492 heces y sangre 116 s�lo heces 299 s�lo sangre Media de edad 23 a�os Labores manuales no agr�colas, amas de casa, y escolares. Poblaci�n. La poblaci�n general se cens� en 1293 habitantes (media 23 a�os), 669 varones (media 24 a�os) y 624 mujeres (media 22 a�os) (t (1276) = 2.449 p = 0.014). 908 personas participaron en el estudio, 70 % de la poblaci�n (IC 95% 67.5 � 72.2) (media 22 a�os) (t (1276) = -5.017 p = 0.000), 435 hombres (47.9 %) (media 23 a�os) y 473 mujeres (52.1%) (media 22 a�os) (t (899) = -0.178 p = 0.859). 502 entregaron una muestra de heces y sangre, 297 s�lo entregaron heces y 109 s�lo sangre, por lo que finalmente se obtuvieron 799 muestras de heces y 611 muestras de sangre. En la tabla 1 se describen las principales caracter�sticas poblacionales. Poblaci�n. La poblaci�n general se cens� en 1293 habitantes (media 23 a�os), 669 varones (media 24 a�os) y 624 mujeres (media 22 a�os) (t (1276) = 2.449 p = 0.014). 908 personas participaron en el estudio, 70 % de la poblaci�n (IC 95% 67.5 � 72.2) (media 22 a�os) (t (1276) = -5.017 p = 0.000), 435 hombres (47.9 %) (media 23 a�os) y 473 mujeres (52.1%) (media 22 a�os) (t (899) = -0.178 p = 0.859). 502 entregaron una muestra de heces y sangre, 297 s�lo entregaron heces y 109 s�lo sangre, por lo que finalmente se obtuvieron 799 muestras de heces y 611 muestras de sangre. En la tabla 1 se describen las principales caracter�sticas poblacionales.

12. Resultados - Par�sitos intestinales identificados Table 1. Intestinal parasites identified in single stool specimens from each of 792 residents of a community in the Peruvian Amazon. 1Specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation).Table 1. Intestinal parasites identified in single stool specimens from each of 792 residents of a community in the Peruvian Amazon. 1Specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation).

13. Resultados - M�todos b�sicos en heces Parasitolog�a intestinal. Larvas de Strongyloides stercoralis fueron detectadas en 73 individuos por alguno de los tres m�todos empleados, mostrando una prevalencia del 9.2 % (IC 95% 7.3 � 11.5). Mediante Observaci�n directa se identificaron 26 muestras positivas obteni�ndose una sensibilidad del 35.6 % (IC 95% 24.63 - 46.60) al compararse con los resultados obtenidos por los tres m�todos, 28 por Sedimentaci�n de Baermann modificado sensibilidad 38.8 % (IC 95 % 27.20 - 49.51), y 55 por el M�todo de sedimentaci�n en copa sensibilidad 75.34 % (IC 95 % 65.45 � 85.23). En la tabla 2 se muestran el resto de par�sitos intestinales hallados por alguna de las tres t�cnicas empleadas. De entre todos los par�sitos hallados, se observ� una marcada asociaci�n entre S. stercoralis y A. duodenale, de manara que los positivos a S. strongyloides presentaban un RR de 3.788 (IC 95 % 1.903 � 7.540) a ser positivos tambi�n para A. duodenale. Mediante el cultivo en agar plato se identificaron como positivas a S. stercoralis 76 de las 515 muestras estudiadas, obteni�ndose una sensibilidad del 64 % (IC 95 % 50.70 - 77.30) y una especificidad del 90.54 (87.88 -93.20). Sin embargo en 180 muestras de las estudiadas hubo un exuberante crecimiento de hongos sobre la muestra lo que dificult� la valoraci�n.Parasitolog�a intestinal. Larvas de Strongyloides stercoralis fueron detectadas en 73 individuos por alguno de los tres m�todos empleados, mostrando una prevalencia del 9.2 % (IC 95% 7.3 � 11.5). Mediante Observaci�n directa se identificaron 26 muestras positivas obteni�ndose una sensibilidad del 35.6 % (IC 95% 24.63 - 46.60) al compararse con los resultados obtenidos por los tres m�todos, 28 por Sedimentaci�n de Baermann modificado sensibilidad 38.8 % (IC 95 % 27.20 - 49.51), y 55 por el M�todo de sedimentaci�n en copa sensibilidad 75.34 % (IC 95 % 65.45 � 85.23). En la tabla 2 se muestran el resto de par�sitos intestinales hallados por alguna de las tres t�cnicas empleadas. De entre todos los par�sitos hallados, se observ� una marcada asociaci�n entre S. stercoralis y A. duodenale, de manara que los positivos a S. strongyloides presentaban un RR de 3.788 (IC 95 % 1.903 � 7.540) a ser positivos tambi�n para A. duodenale. Mediante el cultivo en agar plato se identificaron como positivas a S. stercoralis 76 de las 515 muestras estudiadas, obteni�ndose una sensibilidad del 64 % (IC 95 % 50.70 - 77.30) y una especificidad del 90.54 (87.88 -93.20). Sin embargo en 180 muestras de las estudiadas hubo un exuberante crecimiento de hongos sobre la muestra lo que dificult� la valoraci�n.

14. Resultados - Serolog�a y heces Table 2. Comparison of S. stercoralis serological and stool examination results for 493 participants. 1Stool specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation). Table 2. Comparison of S. stercoralis serological and stool examination results for 493 participants. 1Stool specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation).

15. Resultados - ELISA S. stercoralis Taylor�s method performance characteristics of the ELISA for Strongyloides stercoralis when compared to the gold standard of a positive stool examination. Taylor�s method performance characteristics of the ELISA for Strongyloides stercoralis when compared to the gold standard of a positive stool examination.

16. Resultados - Factores de riego Risk factors for Strongyloides stercoralis detected in stool and by ELISA in multivariable logistic regression models. 1Stool specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation). Risk factors for Strongyloides stercoralis detected in stool and by ELISA in multivariable logistic regression models. 1Stool specimen was considered positive if S. stercoralis was detected by one or more of the three techniques performed (direct exam, modified Baermann method and simple sedimentation).

17. Resultados - Reacciones cruzadas Reacciones cruzadas microfilarias. Siete de los 100 sueros estudiados por el CDC fueron positivos a Brugia mediante el ELISA indirecto y uno solo de estos siete fue positivo cuando se utilizo ant�geno recombinante para Brugia Bm 14. Las tablas 5 y 6 muestran la relaci�n entre los resultados para S. stercoralis y Brugia. Reacciones cruzadas Hookgorm. Al cruzar los resultados para Ancylostoma duodenale discriminado los positivos a Strongyloides stercoralis en heces con los resultados obtenidos en el test de ELISA para S. stercoralis observamos que de los 19 individuos �nicamente positivos a A. duodenale en heces 12 lo eran tambi�n al ELISA para s. stercoralis y 7 no lo heran (X 2 (1)=1.217 p = 0.270).Reacciones cruzadas microfilarias. Siete de los 100 sueros estudiados por el CDC fueron positivos a Brugia mediante el ELISA indirecto y uno solo de estos siete fue positivo cuando se utilizo ant�geno recombinante para Brugia Bm 14. Las tablas 5 y 6 muestran la relaci�n entre los resultados para S. stercoralis y Brugia. Reacciones cruzadas Hookgorm. Al cruzar los resultados para Ancylostoma duodenale discriminado los positivos a Strongyloides stercoralis en heces con los resultados obtenidos en el test de ELISA para S. stercoralis observamos que de los 19 individuos �nicamente positivos a A. duodenale en heces 12 lo eran tambi�n al ELISA para s. stercoralis y 7 no lo heran (X 2 (1)=1.217 p = 0.270).

18. Resultados - Strongyloides y edad

19. Discusi�n Infraestimaci�n de S. stercoralis frente a otros helmintos. T�cnicas b�sicas pueden mejorar el diagnostico en heces. Buena sensibilidad y especificidad del ELISA. No reacciones cruzadas a filarias.

20. Recomendaciones Programas escolares. Programas materno infantiles. Implementaci�n de t�cnicas b�sicas Directo + Sedimentaci�n + Baermann modificado. Programas nutricionales para grupos de riesgo. School based programs- easy gives logistic structure- makes most sense for ascaris, trichuris. Not as good for hookworm, which has a early burden. And obviously, misses everybody not in schoolSchool based programs- easy gives logistic structure- makes most sense for ascaris, trichuris. Not as good for hookworm, which has a early burden. And obviously, misses everybody not in school

21. Agradecimientos Consejo Regional II del Colegio M�dico del Per� Centro para el Control de Enfermedades (CDC) Asociaci�n Ben�fica Prisma Johns Hopkins School of Public Health Caryn Bern Cesar Banda Margaret Kosek Maribel Paredes Robert Gilman Dr S.T.Unt