FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

1. FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

3. GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE

4. esteri dell’acido etilmetansulfonico (EMS) caffeina, nicotina EMS alchila le G la G alchilata si appaia con T invece che con C MUTAGENESI CHIMICApuò essere condotta direttamente sui semi. Agenti alchilanti chimici MUTAGENI radiazioni UV, raggi X radiazioni a, b, g

5. MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA

6. MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati. Si trattano i semi con il mutageno Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post-embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M1) Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.

8. confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione

9. MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE IL GENE VIENE “ETICHETTATO” (GENE TAGGING), PERMETTEDONE UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE

10. Trasformazione con T-DNA Raccolta semi T1 T0 Selezione in serra dei trasformanti T1 Autoimpollinazione T2 Analisi in vitro delle plantule Kan resistenti Raccolta semi T2 Kr Ks Strategia di isolamento di mutanti • Analisi dei mutanti Kan resistenti • Propagazione delle piante

11. gene x T-DNA gene x Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito

12. PCR inversa T-DNA o DS primers

13. T-DNA T-DNA T-DNA RB Ori KanR LB GENE EcoRI EcoRI RB pBR322 KanR LB EcoRI EcoRI RB pBR322 KanR LB EcoRI EcoRI Recupero del plasmide Digestione con EcoRI

14. Recupero del plasmide Ligazione Trasformazione E. coli Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno acquisito il plasmide Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo

15. Mutanti MONOPTEROS (MP) • La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la • regione apicale • Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni • sono disorganizzati • Embrioni dI mutanti mpnon formano il procambio nella parte basale dell’embrione • globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE

16. STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros

17. Funzione del gene MONOPTEROS (formazione della radice embrionale) il meristema radicale (cq, columella) in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD) I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positivi della risposta a IAA BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della risposta all’auxina

18. Destino differenziativo delle due cellule del’embrione bicellulare cellula basale cellula apicale Il meristema apicale della radice ha un’origine mista

19. Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina Geni di risposta primaria (geni precoci): l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica) (oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti) Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano l’espressione dei Geni di risposta secondaria (geni tardivi) (Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)

20. 5 classi principali di geni precoci la cui • trascrizione è indotta da IAA • Proteine AUX/IAA • Proteine SAUR • Proteine GH3 • Glutatione S-trasferasi • ACC sintasi

22. Le proteine AUX/IAA auxin response factors: ARF auxin responsive elements: TGTCTC

23. Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina

24. IAA signaling: regolato dalla via del proteosoma /ubiquitina

25. Via del proteosoma/ ubiquitina E1 enzima attivante l’ubiquitina E2 enzima coniugante l’ubiquitina E3 enzima legante l’ubiquitina

27. IAA: induce la trascrizione dei geni precoci promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA consentendo la formazione di dimeri ARF attivi Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA

28. Mutante TIR-1 TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale) E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53 Skp/ASK1 Rbx1/ROC1/Hrt1 F-box

31. In Arabidopsis: 23 ARF 28 AUX IAA La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizione di geni indotti da IAA Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazione delle proteine AUX IAA (proteosoma) Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma

32. BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12) (repressore della risposta all’auxina) La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma e indotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa

33. I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteine vengano espresse nelle cellule superiori adiacenti Meccanismo non-cell autonomous Cell to cell signaling

34. Modello per la formazione della radice embrionale: • L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento • Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle cellule adiacenti del proembrione • L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD • PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD

35. Gene reporter AuxRE GUS (or GFP) The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs). Hours of staining TGTCTC Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA) Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971.

36. (segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi) AUXINA MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci) fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros) espressi nellle stesse cellule di MP e BDL: TOM3 migra nell’ipofisi

37. MUTANTI AXR6 mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3

38. Mutanti GNOM • Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni • I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono • per tutta l’embriogenesi • I mutanti più estremi sono sferici • abolita completamente la polarità assiale • GNOM necessario per la determinazione • della polarità assiale

39. SVILUPPO DEL MUTANTE gnom WT gnom

40. Il fenotipo dei mutanti gnom è simile a quello dei doppi mutanti mpbdl Ridotta capacità di risposta all’auxina? In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può essere fenocopiato con inibitori del trasporto di auxina

41. Funzione del gene GNOM GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF) Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazione del trafficking intracellulare delle vescicole In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN1 durante l’embriogenesi Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione

42. ADP ribosilazione Complessi GEF-ARF

43. Formazione di vescicole nel TGN

44. ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole

45. Modello per il trafficking di proteine In Arabidospis

46. I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA (proteine PIN) PIN1 TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN

48. The PIN proteins are named for the pin-formed mutant pin-formed, which has a mutation in the PIN1 gene, makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence. Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.

49. PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns PIN Křeček, P., Skůpa, P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology10: 249.

50. PIN proteins orient asymmetrically in plant cells PIN1 localizes to the lower surface of root cortex cells Root Base PIN1 is responsible for auxin flow from shoot apex to root apex. Root Apex Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 71-84.