1 / 28

A Biotechnol ógiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:

A Biotechnol ógiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el: http: //biotech.szbk.u-szeged.hu. A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK EL Ő NYEI F ő ok:

jolie
Download Presentation

A Biotechnol ógiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el: http://biotech.szbk.u-szeged.hu

  2. A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI Fő ok: Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje csak körülményesen nyerhető. KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS IPARI, proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok, polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati felhasználásra KUTATÁSI CÉLOKRA   biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek, 3 dimenziós röntgenszerkezet, mutációs analízis, FELTÉTEL: A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns megfelelője biológiailag ekvivalens

  3. RNA 3 U H OH OH OH OH 1 2 DNA

  4. A DNS felépítése

  5. DNS-olvadáspont Streptococcus DNS olvadási görbéje. Tm= az a hőmérséklet ahol a 50% DNSmegolvadt.

  6. A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés

  7. Annealing vagy Hibridizáció • Lehet • DNS - DNS • DNS - RNS • RNS - RNS

  8. DNS-struktúrák “A” DNS “B” DNS “Z” DNS

  9. hordozó DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik. Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak(vortexes kevertetés) nem tehető ki! Egyéb tisztítási módszerek kromatográfia, - ioncserés DEAE (dietil-aminoetil) kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció eseténA DNS savas  ionos kölcsönhatás - szilikagél alapú elválasztás magas sókoncentráció mellett felkötődik a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik

  10. - CsCl sűrűséggradiens centrifugálás adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez,a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll. különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaság RNS tisztítása RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilak a tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent DEPC: dietil pirokarbonát

  11. RNS tisztítása sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol-kloroform oldattal történő extrakció egy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció.A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható guanidin és izotiociánsav sója

  12. mRNS AAAAAAAAA tRNS rRNS hordozó mRNS AAAAAAAAA TTTTTTTTTT- mRNS AAAAAAAAA mRNS tisztítás eukarióták esetén stabil poliA farok hordozó TTTTTTTTTT- magas só alacsony só

  13. DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS denaturáló nem-denaturáló lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) Nincs roncsoló ágens méret > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp Mátrix agaróz agaróz 0.5- 2% poliakrilamid technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos LÁTHATÓVÁ TÉTEL: etídium bromid, interkaláló festék Þ nem-denturáló körülmények, elsősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is. A DNS 254 nm-en elnyel Þ energia a festékre Þ 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény között radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók .

  14. Agaróz szerkezete etidium bromid & DNS

  15. Horizontális gélelektroforézis

  16. Géldokumentáció

  17. Poliakrilamid gél futtató berendezés

  18. Vertikális gélelektroforézis(PAGE)

  19. DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL - közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t - a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével AGARÓZ • dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis • a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos • kicsapással, univerzális, széles mérettartomány - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-onmegfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális - • kromatográfiás módszerek • 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagélfelületére kötődik, • a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány • DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, • innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható • nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén • jó a kitermelés POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

  20. DNS/ RNS MÉRÉSE A különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van. Egyszálú DNS esetén: e(cm3/(µmol * cm) bázis dA 15.4 dG 11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan e = 10 (cm3/(µmol * cm) Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos. Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul 1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája 50 µg/ml kettősszálú DNS-t 33 µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú RNS-t tartalmazó oldatnak A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A260nm/A280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző A260nm/A280nm 2  tiszta a preparátum A260nm/A280nm 1 - 1,5  sok a fehérje szennyezés Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel.

More Related