UGOTAVLJANJE POTVORB MESNIH IZDELKOV

1. UGOTAVLJANJE POTVORB MESNIH IZDELKOV

2. potvorbe!? Kako dokazati prevelik dodatek vezivnega tkiva (kite, kožice...)? • Kjeldal??? (kaj, pa če je proizvajalec dodal kakšno organsko spojino, da je povečal vsebnost organskega N?) • določiti mišične beljakovine • mifibrilarne (AK, oligopeptide) • ali sarkoplazemske • ali pa kakšno drugo specifično spojino? • določiti količino vezivnega tkiva? Kako dokazati nedeklariran dodatek rastlinskih beljakovin? Kaj pa, če je v tej klobasi deklarirano svinjsko meso zamenjano s piščančjim, ki je cenejše?

4. določanje vsebnosti veznega tkiva vsebnost mišičnih beljakovin • vsebnost hidroksiprolina • metode določanja nekaterih sestavin mišičnih celic z nizkimi molskimi masami • ISO metoda • metoda Bauer • metode ugotavljanja značilne sestave mišičnih vlaken beljakovin • infrardeča spektroskopija POTVORBE določanje vsebnosti rastlinskih beljakovin • mikroskopske metode ugotavljanje vrste (izvora) mesa • imunološke metode • imunološke metode • indirektne metode • izoelektrično fokusiranje • druge metode (DNA/PCR)

5. DOLOČANJE VSEBNOSTI MIŠIČNIH BELJAKOVIN V MESNIH IZDELKIH • najpomembnejše sestavine mesa z vidika človeške prehrane so beljakovine (20 %) • vsebnost beljakovin klasično določamo z metodo po Kjeldahlu (celokupni N x korekturni faktor 6,25 = organski N) • v mesne izdelke (na osnovi mesnih emulzij) poleg čiste mišičnine in mastnega tkiva dodajajo tudi: • večje količine veznega tkiva (kožice, kite, tetive; nižja biološka vrednost, slabša prebavljivost) • tuj (nemesni) dušik: • Na-glutaminat in proteinski hidrolizati (dodajajo se zaradi izboljšanja arome), • razni dodatki z vprašljivimi funkcijami - npr. AK lizin in glicin • nadomestki samo zaradi zvišanja vsebnosti N (sečnina, amonijev klorid) • tuje (nemesne)beljakovine(mlečne, rastlinske beljakovine) • univerzalne kvantitativne analitične metode ni na razpolago: 1. metode določanja nekaterih sestavin mišičnih celic z nizkimi molskimi masami 2. metode ugotavljanja značilne sestave mišičnih beljakovin

6. 1. metode določanja nekaterih sestavin mišičnih celic z nizkimi molskimi masami Za uporabo teh metod morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: • specifičnost sestavine (ne sme se pojavljati v dodatkih nemišičnega izvora) • konstantna vsebnost sestavine v mišičnini različnih vrst živali in različnih mišicah • visoka ekstraktibilnost sestavine • stabilnost sestavine med toplotno obdelavo • kreatin, karnozin, anzerin in balenin.

7. a) Določanje vsebnosti kreatina • je ena od karakterističnih sestavin živalskih tkiv z nizko molsko maso • v živi mišici je prisoten v glavnem v obliki kreatin-fosfata • med posmrtno glikolizo se kreatin-fosfat razgrajuje v kreatin • tkiva in organi vsebujejo različne, tipične količine,enake pri živalih različnih vrst • z naraščanjem količine čiste mišičnine v nekem izdelku naraste tudi vsebnost kreatina • vsebnost kreatina lahko služi za ugotavljanje količine čiste mišičnine v mesnih izdelkih Kreatin analitično določamo z različnimi metodami: • klasične metode (so zamudne) • encimske metode • fotometrične metode • tekočinska kromatografija. Pomanjkljivosti teh metod: • zaradi nizke vsebnosti kreatina v jetrih te metode niso uporabne za izdelke iz jeter • kreatin se med toplotno obdelavo počasi razgrajuje • cena čistega kreatina izredno nizka

8. b) Določanje vsebnosti karnozina, anzerina in balenina • so dipeptidi (sestavljeni iz ß-alanina, ki ima karboksilno skupino vezano na -amino skupino histidina, 1-metilhistidina ali 3-metilhistidina) • pomanjkljivost: nahajajo se v zelo različnih količinah v skeletnih mišicah vretenčarjev • določamo s tekočinsko kromatografijo

9. 2. metode ugotavljanja značilne sestave mišičnih beljakovin Za uporabo teh metod morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: • čim bolj konstantna vsebnost izbrane beljakovine v mišičnini klavnih živali (ta pogoj bolje izpolnjujejo miofibrilarne kot sarkoplazemske belj.) • postopek izdelave izdelka, zlasti toplotna obdelava, ne sme vplivati na lastnosti izbrane beljakovine. I. Določanje aminokislin II. Določanje peptidov

10. I. Določanje aminokislin a) Določanje vsebnosti metiliranih aminokislin • polipeptidne verige miofibrilarnih belj. vsebujejo majhne količine metiliranih AK • primerni sta dve metilirani AK: • 3-metil-histidin (Nt-MeHis; 3-MeHis; 3 metilne sk. vezane na histidin, aktin) • metil-lizin (-N-monometillizin; MeLys), ki se nahaja v miozinu • ta metoda se še ne izvaja b) Določanje aminokislinske sestave vzorca • vsaka belj. ima svojo značilno AK sestavo - posredno določanje čiste mišičnine • določanje z aparati na principu infrardeče spektroskopije • prednosti teh metod: • je zanesljiva in natančna • čas analize pa je izredno kratek (rezultat dobimo v nekaj minutah) • dva osnovna principa: • merjenje intenzitete odbite energije • merjenje zmanjšanja intenzitete transmitirane energije • absorbcija energije pri specifičnih valovnih dolžinah je v določenem odnosu s kemijskimi vezmi v masteh, belj. in OH

11. II. Določanje peptidov • lastnost, ki je za neko beljakovino še bolj specifična kot njena AK sestava, je primarna struktura beljakovine • cepitev na peptide s pomočjo proteolitičnih encimov (npr. tripsin, kimotripsin) ali pa s pomočjo nekaterih selektivnih reagentov (npr. cianogen bromid) • dobljene oligopeptide kvantitativno izoliramo iz zmesi in jih kvantitativno določimo s pomočjo kromatografskih metod • vsebnost določenih oligopeptidov je merilo za vsebnost čistih mišičnih beljakovin v nekem mesnem izdelku • v praksi se ta način določanja vsebnosti čiste mišičnine v mesnih izdelkih še ne uporablja. vse analitične metode za določanje vsebnosti čiste mišičnine v mesnih izdelkih imajo določene pomanjkljivosti in so še vedno v fazi raziskovanja in izpopolnjevanja ter se v glavnem v praksi še ne uporabljajo

12. DOLOČANJE VSEBNOSTI VEZNEGA TKIVA V MESNIH IZDELKIH • vezivno tkivo: kolagen, elastin in retikulin • slabše prebavljivo • po TO je kolagen lažje prebavljiv, elastin pa še vedno ne • manj esencialnih AK - nižja biološka vrednost • pravilnik omejuje vezivo v svežem, mletem mesu • analize niso problematične, a so dolgotrajne • temeljijo na določanju AK hidroksiprolin (12 – 13 % v vezivu): 1. metoda določanja vsebnosti hidroksiprolina po Neumanu in Loganu, modificirana po Möhlerju in Antonacopoulosu 2. ISO metoda, izpeljana iz metode Stegemann-Stalder 3. metoda Bauer (1991) 4. infrardeča spektroskopija

13. 1. Metoda določanja vsebnosti hidroksiprolina po Neumanu in Loganu, modificirana po Möhlerju in Antonacopoulosu: Princip: • hidroliza vzorca z SnCl2 16 ur pri 105 °C - sproščanje hidroksiprolina iz kolagena • oksidacija hidrolizata s kloraminom • dodajanje barvnega reagenta (diaminobenzaldehid + perklorna kislina + izopropanol) • fotometrično merjenje rožnato-rdeče barve • metoda je zelo dolgotrajna 2. ISO metoda, izpeljana iz metode Stegemann-Stalder • krajša - čas hidrolize 7 ur • kolorimetrično merjenje oksidiranega hidroksiprolina ob uporabi barvnega reagenta (p-dimetilaminobenzaldehid + perklorna kislina + n-propanol) 3. Metoda Bauer (1991) • hidroliza z mikrovalovno tehniko (s HCl pri 5,9 bar) - čas hidrolize = 30 minut • fotometrično določanje vsebnosti hidroksiprolina • čas celotne analize je 2 uri 4. Infrardeča spektroskopija • v 1 uri se kvantitativno določi kolagen v 8 do 10 vzorcih

14. DOLOČANJE RASTLINSKIH BELJAKOVIN V MESNIH IZDELKIH • vloga rastlinskih belj. (SVV, tekstura, zvišanje vsebnosti beljakovin) • če niso deklarirane - potvorba izdelka • sojini proteini • metode: 1. mikroskopske 2. imuno-kemijske (imunološke) (kvantitativni testi) 3. indirektne (kvantitativni testi)

15. 1. mikroskopske metode • kvalitativni testi - paličaste celice in celice v obliki peščene ure 2. imuno-kemijske (imunološke) metode (kvantitativni testi) • temeljijo na specifičnih reakcijah med antigeni (npr. sojin protein) in njihovimi protitelesi, prisotnimi v antiserumu, ki se tvori v poskusni živali • specifično vezanje antigena na ustrezno protitelo, razultat je oborina, zlepljanje 3. indirektne (kvantitativni testi) • temeljijo na določanju vsebnosti nekaterih ne-proteinskih sestavin v preparatih soje • določanje vsebnosti polisaharidov, oligosaharidov, na proteine vezanih sladkorjev, prostih aminokislin in peptidov, fitatov, saponinov, sterolov, kovin - kot indeksov za sojine oz. rastlinske beljakovine • sestavine specifične za sojo, kemijsko stabilne med postopki predelave in med skladiščenjem, njihova količina v sojinih preparatih pa mora biti konstantna • visoko tlačna tekočinska kromatografija • mangan in magnezij • izolati sojinih proteinov so običajno brez spremljajočih snovi, zato se dodajajo indikatorji, "sintetični markerji”, titanov dioksid

16. UGOTAVLJANJE VRSTE (IZVORA) MESA • strojno odkoščeno meso - vizuelno je nemogoče ločiti vrsto mesa

17. UGOTAVLJANJE VRSTE (IZVORA) MESA Identifikacija posameznih vrst mesa je zelo pomembna zaradi: • pravnih: različne države in organizacije predpisujejo svoja pravila, kakšni morajo biti izdelki, katere vrste mesa so lahko prisotne v posameznih izdelkih ali katerim pogojem morajo izdelki ustrezati. • ekonomskih: nekateri proizvajalci prodajajo meso in izdelke cenejše vrste pod deklaracijo druge vrste (tune, perutnina...) • religioznihvzrokov: poznamo predvsem problem s prisotnostjo svinjine zaradi muslimanov (govedina – Indija, vegetarijanci...) Konvencionalne metode temeljijo na identifikaciji beljakovin posameznih vrst mesa: elektroforeza in imunološke metode (kvalitativno, ne moreta ločevati mesa sorodnih živali!!) DNA/PCR tehnike – novejše metode

18. 1. imunsko-kemijske (imunološke) metode • reakcije antigeni/protitelesa - obarjalni testi • metoda ELISA (enzyme - linked imunosorbent assay) - testiranje antigenov in protiteles - diferenciacija različnih vrst presnega mesa) • razlaga metode: a) sendvič sistem —l–< —l–<A —l–<A>—l–E —l–< reakcija —l–<A >—l–E —l–<A>—l–E —l–< + A  —l–<A  —l–<A>—l–E —l–< —l–<A —l–<A>—l–E —l–< —l–<A —l–<A>—l–E protitelesa antigeni protitelesa, markirana protitelesa, (v vzorcu) markirana z vezana na antigene encimom b) dvojni sendvič .....)

19. 2. izoelektrično fokusiranje - diferenciacija različnih vrst mesa v izdelkih, toplotno obdelanih do 100 °C (primerna za sveže in zmrznjeno meso) • ekstrakcija proteinov iz vzorca • razstavljanje proteinov na komponente z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu (glede na njihov naboj, velikost in izoelektrično točko) • barvanje (po različnih metodah) in izvrednotenje komponent (vzporedno s standardom) • kot dokument (prstni odtis proteinov, dokaz) služi fotografija gela z obarvanimi komponentami proteinov vzorca Analiza je končana v 2 do 3 urah. 3. druge metode za identifikacijo mesa v toplotno obdelanih izdelkih • določanje specifičnih toplotno stabilnih sestavin (npr. piščančje meso se od prašičjega loči po razmerju dipeptidov anzerin/karnozin) • določanje vrste živalske maščobe (analiza maščobnih kislin, tipičnih za posamezno vrsto živali, vendar moti prehrana) • diferenciacija vrst mesa z določanjem peptidov po razgradnji s tripsinom (tenkoplastna kromatografija in HPLC) • DNA/PCR tehnike: temeljijo na določanju DNA fragmentov določenih vrst, zelo občutljive metode, možno kvantificiranje