1 / 45

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

Molekulārās metodes mikrobioloģijā. Teorija 2 . Plazmīdu DNS izdalīšana. 20 12 ./20 13 . mācību gada 2 . semestris. Māris Lazdiņš. Plazmīdu v ekoru DNS ieguve. Plazmīdu DNS ieguvē var izdalīt 3 pamatstadijas: 1. Vektoru saturošo baktēriju audzēšana (arī plazmīdu DNS amplificēšana),

keiran
Download Presentation

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulārās metodes mikrobioloģijā Teorija 2. Plazmīdu DNS izdalīšana 2012./2013. mācību gada 2. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Plazmīdu vekoru DNS ieguve Plazmīdu DNS ieguvē var izdalīt 3 pamatstadijas: 1. Vektoru saturošo baktēriju audzēšana (arī plazmīdu DNS amplificēšana), 2. Baktēriju savākšana un šūnu lizēšana, 3. DNS izdalīšana un attīrīšana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Lai novērstu heterogēna DNS maisījuma ieguvi, ir būtiski sējmateriālu ņemt no vienas kolonijas. Ja materiāls ņemts no muzeja, baktērijas sēj atšķaidījumos, lai veidotos atsevišķas kolonijas. Ja tiek pavairotas rekombinantas plazmīdas no transformētām kultūrām, vēlams paralēli parauga daļu saglabāt muzejā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. Pēcpusdienā 5 - 10 ml barotnē ar atbilstošo antibiotiku iesēj naktskultūru. Nākamajā rītā 25 ml barotnē ar atbilstošo antibiotiku inokulē 0,1 - 0,25 ml naktskultūras. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. Inkubē optimālos apstākļos ar labu aerāciju (piemēram, šūpojot). Nosacījums labai aerācijai - kolbā kultūra nedrīkst būt vairāk kā 1/3 no kolbas tilpuma. Pretējā gadījumā vajadzīga piespiedu aerācija sūknējot cauri gaisu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. Inokulācijas kultūru audzē līdz vidējai "Log" fāzei - OD600=0,6. Tad visus 25 ml inokulē DNS izdalīšanas kultūrā - 500 ml tās pašas barotnes ar atbilstošo antibiotiku. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. Lai neapstādinātu straujo augšanu, barotnei jābūt iepriekš uzsildītai līdz vajadzīgajai temperatūrai. Labu aerāciju nodrošina ar aktīvu šūpošanu, izmantojama 2 l tilpuma kolba. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. Straujā augšana un barotņu maiņa nepieciešama, lai saglabātu selektīvo spiedienu un nesaaudzētu lielu masu ar plazmīdu nesaturošām baktērijām. Īpaši būtiski tas ir ampicilīna rezistences gadījumā, jo ß-laktamāzi baktērijas izdala periplazmatiski (barotnē). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. ColE1 (pMB) atvasinātajām plazmīdām bez kopiju skaita kontroles (piemēram pUC sērija) šūnas audzē 4 -5 stundas (OD600=0,8-1,0). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga pDNS izdalīšanai. ColE1 (pMB) atvasinātajām plazmīdām ar ierobežotu kopiju skaitu (piemēram pBR sērija) šūnas audzē 2 stundas(OD600=0,4) un tad veic plazmīdu amplifikāciju ar hloramfenikolu (12-16 stundas). Plazmīdu amplifikācijas vajadzībām hloramfenikolu barotnei pievieno ar beigu koncentrāciju 125 - 170 mg/ml LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. Hloramfenikols - (arī hloromicetīns, levomicetīns). Plašas iedarbības bakteriostatiska antibiotiska viela, kuru atklāja 1949. gadā aktinobaktērijās (aktinomicētēs). Pašlaik iegūst tikai sintētiski. Hloramfenikolam piemīt bakteriostatisks efekts - tas saistās pie baktēriju ribosomas 50S subvienības un inhibē peptidil-transferāzes aktivitāti - peptīdsaites veidošanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Col E1 (pMB) ORI ColE1 ORI ir relaksēta replikācijas kontrole. Replikācijai nepieciešami vairāki baktērijas genoma kodēti proteīni: RNS polimerāze, DNS polimerāze I, DNS polimerāze III, RNāze H, helikāze (DnaB). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Col E1 (pMB) ORI Replikācija notiek vienā virzienā. Plazmīdas replikāciju kontrolē trīs pašā plazmīdā ietvert gēnu produkti: - RNS I gēna produkts - RNS I, - RNS II gēna produkts - RNS II, - rop gēna produkts - Rop proteīns. Rop - repressor of primer LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. RNS II ORI Col E1 (pMB) ORI Replikācijas iniciācija: E. coli RNS polimerāze sintezē RNS II(apmēram 550 nt). RNS II ORI rajonā izveido sekundāro struktūru LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. RNS II ORI Col E1 (pMB) ORI Replikācijas iniciācija: Sekundāro struktūru atpazīst RNāze H un sašķeļ RNS II molekulu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. DNS pol I Col E1 (pMB) ORI Replikācijas iniciācija: Plazmīdas ORI rajonā veidojas sapārots DNS/RNS himērs ar brīvu -OH grupu 3’ galā, kas kalpo par praimeri DNS polimerāzei I, lai uzsāktu DNS replikāciju. RNS II ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. RNS II RNS I ORI Col E1 (pMB) ORI Replikācijas kontrole: Replikāciju kontrolē RNS I, kura ir komplementāra RNS II 5’ daļai, un, veidojoties RNS I - RNS II dimēram, izmainās RNS II sekundārā struktūra RNS II ar izmainītu struktūru vairs nav RNāzes H šķelšanas objekts un praimeris netiek izveidots. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Col E1 (pMB) ORI Replikācijas kontrole: RNS I tiek sintezēta no plazmīdas DNS. Jo šūnā vairāk plazmīdu, jo lielāka ir RNS I koncentrācija - attiecīgi, pieaug iespēja, ka tā efektīvāk saistīsies ar RNS II un nomāks jaunas DNS replikācijas uzsākšanos. RNS II RNS I ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. RNS II Rop RNS I ORI Col E1 (pMB) ORI Replikācijas kontrole: Negatīvajā regulācijā līdzdarbojas plazmīdas kodēts proteīns - Rop. Tas specifiski saista RNS I/ RNS II dimēru un papildus nostiprina tā struktūru, vienlaicīgi samazinot plazmīdas replikācijas uzsākšanās iespējas. Rop LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. Col E1 (pMB) ORI Replikācijas kontrole: Jo vairāk plazmīdas kopiju => - vairāk RNSI, - vairāk proteīna - Rop => Mazāka iespēja sākties jaunai plazmīdas replikācijai. RNS II Rop Rop RNS I ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Plazmīdu amplifikācija Antibiotiska viela - hloramfenikols specifiski saistās ar prokariotu ribosomām, traucējot proteīnu sintēzi. Hromosomas replikācijas uzsākšanai nepieciešama dažādu jaunu proteīnu sintēze. Plazmīdu replikācijai vajag stabilus enzīmus - RNS polimerāzi II, DNS polimerāzi I un III, RNāzi H. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. Plazmīdu amplifikācija Šie enzīmi atrodas citoplazmā salīdzinoši lielā daudzumā. Hloramfenikols kavē arī salīdzinoši nestabilā Rop proteīna sintēzi. Līdz ar to, inkubējot baktērijas hloramfenikola vidē, iespējams vairākkārtīgi palielināt ColE1 grupas (un citu, bet ne visu) plazmīdu kopiju skaitu šūnās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. Šūnu savākšana Baktērijas savāc centrifugējot 0oC 5-10 min. pie 4000 - 6 000 g. Dažreiz iegūtās DNS kvalitāte uzlabojas, ja baktērijas mazgā resuspendējot 100 - 200 ml 0oC STE bufera: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH7,8; 1 mM EDTA. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. Plazmīdu atdalīšana Plazmīdu DNS ieguve balstās uz atšķirībām starp pDNS un genomiskās DNS fizikālajām īpašībām. pDNS izdalīšanā tiek ietvertas DNS denaturēšanas stadija, kurā lielā genomiskā DNS tiek daļēji sabojāta, bet pDNS paliek cirkulāru molekulu veidā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. Plazmīdu atdalīšana Praktiski visās plazmīdu DNS ieguves metodēs tiek lietota secīga DNS denaturēšana un renaturēšana. Garie, dažādās vietās fragmentētie genomiskās DNS pavedieni renaturējas lēni un nepareizi, kā rezultātā to vairums paliek daļēji denaturētā un mazšķīstošā formā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. Plazmīdu atdalīšana LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. Plazmīdu atdalīšana NaOH, SDS - sārmainā DNS denaturēšanās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. Plazmīdu atdalīšana DNS renaturēšana (paskābināts Na-acetāts) Cirkulārās, lielā kopiju skaitā esošās pDNS molekulas ātri renaturējas un atrodas šķīdumā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. Šūnu lizēšana Parasti tiek apvienota ar DNS denaturēšanu. Populārākās metodes ir: - apstrāde ar palielinātu temperatūru (vārīšanu) un - sārmainā līze SDS klātbūtnē. Abās metodēs baktēriju šūnapvalku lizēšanu iesaka uzlabot, izmantojot lizozīmu (gala konc. 2-5 mg/ml). Lizozīma darbība ir efektīvāka, ja vides pH vienāds vai lielāks par 8,0. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. Šūnu lizēšana Metode ar vārīšanu ir ātrāka, taču šeit ir problemātiska pareizā vārīšanas laika izvēle. (atbilstoši lietotajam tilpumam, materiāla formai un temperatūras apmaiņas efektivitātei) Nepieciešama liela ātruma centrifugēšana (ultracenrifugēšana). Tiek izmantots deterģents Trtons-X100. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. Šūnu lizēšana Sārmainās līzes metode rit ilgāka, taču iznākums ir drošāks. Savāktās šūnas resuspendē ~ 10 ml I šķīduma un tur 5 min. istabas temperatūrā. I šķīdums (GTE): 50 mM glikoze; 25 mM Tris-HCl, pH8,0; 10 mM EDTA; (lizozīms 5 mg/ml). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. Šūnu lizēšana Baktērijas jāuzduļķo viendabīgā masā, jo salipušo šūnu pikas netiks nolizētas! Pievieno 2 tilpumus svaigi pagatavota (!) II šķīduma: 0,2 N NaOH 1,0 % SDS. Samaisa invertējot un tur 5-10 min. (ilgāk nevajadzētu) ledus vannā. Izteikti sārmainā vide denaturē DNS. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. DNS sārmainā denaturēšana Heterociklisko bāzu tautomerizācija - tautomērās formas veidošanās. Keto - forma (pamatforma) Enol - forma (ļoti īslaicīga) Guanīns Timīns LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. O- | C C C OH | C C C Enol -formas Par enoliem sauc spirtus, kuros -OH grupa piesaistīta C atomam, kurš vienlaicīgi veido arī dubultsaiti ar kādu citu atomu. Enolu -OH grupa spēj disociēt vidē H+ jonu, veidojot enolātu anjonus vai enolātus, kuri ir stabilāki savienojumi. H+ LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. DNS sārmainā denaturēšana Stipri sārmainā vidē (pH>10) enol-formas zaudē protonu un kļūst par enolātiem. Enolāti - samērā stabila forma Enolāts Guanīns Timīns OH- + H2O OH- + H2O LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. DNS sārmainā denaturēšana Ūdeņraža saites starp komplementārajiem heterociklisko bāzu pāriem, kuras nodrošina DNS divpavedienu struktūru. A - T G - C LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. DNS sārmainā denaturēšana Sārmainās vides ietekmē starp komplementārajiem heterociklisko bāzu pāriem veidojas nepietiekams ūdeņraža saišu skaits, lai saglabātu DNS divpavedienu struktūru. A - T G - C X X X X LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. NS sārmainā denaturēšana Šādu metodi mēdz izmantot DNS molekulām. RNS sārmainā vidē ir ievērojami nestabilākas kā DNS, līdz ar to RNS molekulām sārmaino denaturēšanu parasti neveic, vai arī tas jādara precīzi kontrolējot denaturēšanas apstākļus (vides pH, temperatūra, sārma iedarbības laiks u.c.). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. DNS renaturēšana DNS renaturēšanos un vienlaicīgi arī nepilnīgi renaturētās genomiskās DNS un daļēju proteīnu izsālīšanu panāk, pievienojot 1/2 tilpuma paskābinātu kālija vai nātrija acetātu (pH4,8; K+/Na+ 3M, acetāts 5M). Samaisa lēni invertējot un tur 10 min. ledus vannā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. pDNS atdalīšana Nepilnīgi renaturēto genomisko DNS un izsālītos proteīnus atdala centrifugējot. Plazmīdu DNS kopā ar RNS frakciju izgulsnē pievienojot 0,6 tilpumus konc. izopropanola (2 tilpumus konc. etanola). Samaisa invertējot un tur 15 min. istabas temperatūrā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. pDNS atdalīšana NS savāc centrifugējot. Pazeminātā temperatūrā var notikt sāļu kristalizēšanās! Nogulsnes mazgā ar 70% etanolu, apžāvē un šķīdina TE buferī vai ūdenī. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. pDNS attīrīšana Vēlama vēl papildus attīrīšana. Var veikt: - centrifugāciju cēzija hlorīda gradientā; - RNS izgulsnēšanu ar LiCl; - RNS noārdīšanu ar RN-āzi; - fenola/hloroforma ekstrakciju, lai labāk atbrīvotos no proteīniem; - precipitāciju ar polietilēnglikolu, lai atbrīvotos no īsiem NS fragmentiem; - DNS hromatogrāfisku attīrīšanu u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. 15. 22. 24. 26. 33. 18. pDNS izdalīšana un attīrīšana Solis pDNS izdalīšanas protokolā. ... LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. dimēri LF OC LF SC CCC pDNS 1 2 3 4 5 6 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. ... LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related