Propiedades antivirales de las proteínas y péptidos de la leche

1. Propiedades antivirales de las proteínas y péptidos de la leche RAVINDER NAGPAL1, CHAITANYA. S1, MONICA PUNIYA2, AARTI BHARDWAJ3, SHALINI JAIN4 AND HARIOM YADAV4* 1Microbiología láctea, 2Nutrición de ganado de lácteos, 4Bioquímica animal, Instituto Nacionald e Investigación Láctea, Karnal 132001, Haryana, Instituto Meerut de Ingeniería y Tecnología, Meerut-250002, U.P., India. *Email: yadavhariom@gmail.com

2. Introducción • Las proteínas y péptidos de la leche poseen propiedades biológicas más allá de su significancia nutriológica. • En 1987, lactoferrina (LF) - Virus asociado a leucemia (FLV) • Proteínas y péptidos de la leche modificadas químicamente.

3. Proteínas con actividad antiviral: • Lactoferrina (LF) • Lactadherina • Glicoproteína • Inmunoglobulina (Ig)

4. Lactoferrina (LF) • Hierro multifuncional unido a glicoproteína • Liberada en el estómago por pepsin cleavage a pH ácido • LF - Actividad antiviral para virus DNA y RNA

5. ACCIÓN DE VIRUS ENVUELTOS POR LF: • Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) • Citomegalovirus humano (CMV) • Virus del herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV) • Virus de la hepatitis B, C y G • Papilomavirus humano (HPV) y • Alfavirus

6. - Virus no cubiertos: • Rotavirus • Enterovirus • Poliovirus • Adenovirus y • Calicivirus felinos

7. Efectos antivirales de las proteínas

11. Mecanismos antivirales de LF

12. Mecanismo de acción • Primero, LF parece interactuar con los receptores de la superficie celular, tales como los glicosaminoglicanos los cuales son sitios de unión para muchos virus. • Segundo, LF se une directamente a partículas virales e inhibe la adsorción viral a células objetivo.

13. Efectividad antiviral: • Las diferencias en secuencia de aminoácidos de región antiviral • Cadenas de Glycan y el número de puente disulfuro entre hLF y bLF • HIV, HSV, CMV y adenovirus, reconocen proteoglicanos de la superficie celular (heparina y sulfato de heparina) como receptores.

14. Entrada de HIV-1 en las células objetivo • Mediada por glicoproteina gp-120 y gp-41 • Receptor CD4 y co-receptores CCRS, CXCR4 • Fusión de membranas celulares y virales

15. Cont… • Interacción entre el curva V3 y heparan sulfato adhiere el virus a la superficie celular • Componentes positivamente cargados (AMD3100 y ALX40-4C) bloquean la replicación de VIH-1, interactúan con co-receptores cargados negativamente.

16. Purificación de las proteínas y péptidos de la leche de vaca α-S2 Caseína, LFcina-B bovina y k-caseína bovina Hidrólisis con pepsina Cromatografía de intercambio de cationes Fragmentos obtenidos caracterizados por HPLC y ESI-MS

17. Cont… • β-caseína bovina y β lactoglobulina son modificadas por ácido maleico (Ikura et al., 1984) • As2-caseína es modificada con 3-hidroxiftalico anhídrido • El grado de modificación checado con orto-ftaldialdeído.(Berkhout et al., 1997)

18. Métodos para checar propiedades antivirales • ELISA • Ensayo MTT • Método de radioisótopos

19. 1. ELISA Adicione proteína de leche(1-10 µM ),antes de adicionar el virus VIH-1 Supresor T1 del crecimiento de la línea celular en medio RPMI con 10% FCS a 37 ºC en 5% CO2 Virus sembrado en un pico de producción y almacenado a - 70 ºc Cuantificado en antígeno CA-P24 ELISA

20. 2. Ensayo MTT Línea celular MT2 T infectada con VIH-1 - aumentó la concentración de proteínas de la leche. Después de 5 días de post-infección Células vivas convierten el MTT {3-(4,5-dimethylethiazole-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Producto azul (formazina)

21. 3. Método de radioisótopo Vaso de cultivo celular (Nunclon de 24 placas) Inhibidores de proteínas no específicas Adiciones aupresor de células T1 en un medio completo (RPMI) Etiquete radiactivamente con 125 I-bLF e incube las placas de 4 ºc a 37 ºc por 1 hora Cantidad de radioactividad recuperada fue determinada por contador Gamma.

22. Resistencia a lactoferrina • Aislamiento HIV-1 LA1 cultivado en presencia de 10µM bLF • Células libres de virus son pasadas a células supresoras T1 no infectadas. • Observe la formación masiva de sincitio en el cultivo • Muestra del virus es tomada después de varios días.

23. Cont… 5. Prueba para infección paralela con y sin LF 6. Células infectadas congeladas a -80 ºc para análisis subsecuente de DNA 7. PCR amplificada , Gel purificada y clonada en una vector clonador. 8. Múltiples clones son insertados como fragmento Bam H1 en el clono moclecular PLA I 9. Pruebe su capacidad de replicación con y sin bLF

24. Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la replicación de VIH-1 • Sin actividad antiviral los péptiodos cargados negativamente • b-caseína 1-28 • kcaseína 1-10 y • CMP-A y CMP- B a 10 mM • Inhibición viral completa - proteína de la leche cargada negativamente modificada químicamente 3HP-CN

25. Cont… • Péptidos cargados positivamente nisina y lactoferricina • 10 µM - moderadamente inhiben VIH-1 • 100 µM - completa inhibición pero se observa citotoxicidad • bLF significativamente inhibe a concentración de 0.1-1.0 µM • LF humana - proteína nativa y recombinante moderadamente actúan como inhibidores a concentración de 3.1 µM

26. Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5-usando virus • Lactoferrina tiene cargas positivas y negativas a pH fisiológico • Eso interfiere con la interacción virus-co-receptor • Estos VIH-1 usados para infectar línea celular U87CD4 que fueron transfectadas con CXCR4/CCR5

27. Cont… • bLF es un componente superior anti- VIH-1 comparado con LF humana y LF murina, en cualquier forma, nativa o recombinante • bLF es 69% y 64% identica a hLF y mLF respectivamente • Plasma bovino y proteínas de la leche están ampliamente disponibles • Estas proteínas industriales son producidas a gran escala, a través de simples modificaciones químicas

28. Cont… • Provee antivirales relativamente baratos para administración local o sistémica • Uso sistémico de proteínas de la leche químicamente modificadas en el humano puede ocasionar mayor toxicidad y problemas de inmunogenicidad • Excepto la suc-HAS & 3HP-LA que muestra bajo nivel de toxicidad e inmunogenicidad

29. Propiedades antivirales de otras proteínas de la leche • Lactadhesina • Glicoproteina • Inmunoglobulina (Ig)

30. Lactoadhesina: • Receptor que se une a virus • Ácido siálico juega un papel importante en su acción antiviral • Lactoadhesina humana protege a los lactantes alimentados al seno contra infección sintomática por rotavirus

31. Glicoproteína: • Fracción de alto peso molecular de la leche de bovinos • Efectiva contra rotavirus humano in vitro • Inmunoglobulina láctea: • Hiperinmunizada con rotavirus humano durante la gestación de vacas. • 100 veces- leche humana • 10 veces – IG comercial

32. Péptidos antivirales derivados de las proteínas de la leche • Lactoferricina • GMP • Complejo mucina

33. Efecto antiviral de péptidos

35. Fomento de actividad antiviral por modificación química • Modificaciones químicas dan lugar a cambios en las cargas sobre las proteínas de la leche lo cual puede fomentar sus propiedades antivirales (Swart, Harmsen, et al., 1999; Waarts et al., 2005) • Dos principales formas: • Acilación para aumentar cargas negativas • Aminación para aumentar cargas positivas

36. Cont… • Succinilación y aconitilación de LF tienen efectos más fuertes anti- VIH-1 (2-4 veces más activos que la LF original) (Swart, Harmsen, et al.,1999) • Algunas otras proteínas - b-Lg, a-La y HSA, también han incrementado el efecto contra VIH-1 y VIH-2 (Jiang, Lin, Strick, Li, & Neurath, 1996) • Cargas negativas adicionales fueron introducidas a través de modificaciones de residuos de lisina.

37. Cont… • b-Lg modificada con ácido 3- hydroxyphthaloyl (3HP) interfirió con la infección por HIV-1, HSV-1 y 2, y HCMV (Berkhout et al., 2002; Swart, Kuipers, et al., 1996) • También se encontró que 3HP-a-La y 3HP-as2-caseína fueron también efectivos contra HIV-1

38. Cont… • 3-HP-b-Lg podría ser un agente eficaz para prevenir transmisión vaginal de infecciones por el virus herpes virus. • Aumento de carga positiva neta sobre LF • Aminación deroga su efecto anti-VIH pero incrementa el efecto anti-HCMV • Acilación inhibe propiedades anti-HCMV de LF pero es efectiva contra el virus de la influenza.

39. Conclusión • Proteínas de la leche mejoran la salud de pacientes afectyados por infecciones virales. • LF bovina mostró considerable acción inhibitoria contra la mayoría de los virus. • Resultados de investigación emprendidas a la fecha, primariamente bajo condiciones in vitro. • En años recientes, efectos in vivo han sido reportados en modelos de ratones y ratas.

40. Cont… • A corto plazo, para prevención y terapia de infecciones virales en animales y humanos. • Beneficios de algunas de las modificaciones químicas observadas in vitro podrían explorarse. • Para aplicaciones específicas en atención en salud de humanos y animales.