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Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie. Definizione della patologia. Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane Classificazione clinica – gravità Classificazione genetica – tipo di catena Classificazione molecolare – tipo di mutazione. Classificazione clinica.
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Definizione della patologia • Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane • Classificazione clinica – gravità • Classificazione genetica – tipo di catena • Classificazione molecolare – tipo di mutazione AM-tbmadc
Classificazione clinica • Major (idrope fetale, b-tal major) • Intermedia (b-tal interm., HbH) • Portatore (a e b) • Portatore silente (a e b) AM-tbmadc
STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO (colorazione May-Grunwald-Giemsa) Soggetto normale Portatore di b-talassemia Nel portatore di b-talassemia è rilevabile: aspetto ipocromico, aniso-micro-poichilocitosi delle emazie, presenza di schistociti, emazie a bersaglio, ed emazie a lacrima. I.Bianco Silvestroni, 1998 AM-tbmadc
b-TALASSEMIA: alterazioni ematologiche AM-tbmadc
a-talassemia: alterazioni ematologiche AM-tbmadc
Heterogeneity of hemoglobinopathies in Mediterranean a-thal alleles (18) b-thal alleles (47) d-thal alleles -a(3.7) initiation cd ACCATG - - CATG a2 ATGACG a1 ATGGTG a2 cd 29 TC (Agrinio) a2 IVS1 (-5nt) a2/a1 cd 110 CA (Petah Tikva) a2 cd 142 TA (Icaria) a2 polyA ATAAATGA -a3.7 -a4.2 -a3.7 Hb Hasharon -(a)20.5 --MED-I --MED-II -(a)5.2 --(MA) --(CL) --(CAL) 5 - CT 8/9 + G 30 C 1-1 A 1-2 A 1-2 G 1-5 C 1-5 T 1-110 A 1-116 G 1-130 C 39 T 37 A 44-C 54-T 59-A 7-C 2-705 C 2-745 G 2-843 G 2-844 A 2-850-G 2-850 C -101 T -92 T UTR +10-T + 33 G 2-844 G AATAAG -90 T -88 A -88 T -87 G -87 T -87 A -86 A -31 C -30 A -30 C 6 - A 8 - AA 27 T 1-5 A 1-6 C 2-1 A AACAAA AATGAAA -65 AG -55 TC cd 4 CT cd 27 GT Corfù –7.2 Kb Hb Lepore db-thal alleles Sardinian Sicilian Spanish Turkish Macedonian HPFH -196 Ag C T -117 Ag G A HPFH –4 HPFH –5 Structural variants HbS HbC HbD Punjab HbO-Arab AM-tbmadc
Cap Poly-A AM-tbmadc
TATA box + • 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene AM-tbmadc
Fattori di trascrizione del gene b-globinico • GATA-1 + FOG (GATA: 2 domini Zinc-finger) • NF-E2 (PLTs) • EKLF (3 Zinc-finger; switch) • Fattore stadio-specifico (SSP; stimola g) AM-tbmadc
RELATIVE FREQUENCIES OF b-THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE AM-tbmadc Galanello et al, TIF 2003
RELATIVE FREQUENCIES OF b-THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE AM-tbmadc Galanello et al, TIF 2003
Epidemiology of thalassemia: global estimate • Carrier rate 4.9% of world populat. • Total carriers 300,000,000 • Newborn carriers with Hb disorders 6.1% • Newborns with a major Hb disorders 2.1/1000 • Affected births/year 307,000 (WHO 1998) AM-tbmadc
Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore talassemico • MCH, MCV • HbA2, HbF • Assetto emoglobinico • Metabolismo del Ferro • Sintesi delle catene globiniche • Analisi dei geni globinici • Studi famigliari AM-tbmadc
Fenotipo “classico” del portatore di b talassemia MCV, fL 67 ± 6 MCH, pg 22 ± 2 HbA2, % 5 ± 1 Hb elettroforesi A + (F) + A2 Rapporto a/b > 1,20 AM-tbmadc
Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di b-talassemia Falsi positivi: - a talassemia - a. sideropenica Falsi negativi: - interazione a, b talassemia - deficit folati e B12 AM-tbmadc
Doppia eterozigosi per a e b talassemia -a/aa -a/aa MCV, fl 76.0 MCH, pg 26.0 HbA2, % 2.5 MCV, fl 72.2 MCH, pg 23.3 HbA2, % 5.6 -a/-a MCV, fl 83.2 MCH, pg 28.1 HbA2, % 6.0 AM-tbmadc
Correlazione genotipo-fenotipo • Fenotipo eterogeneo per: • Gravità della mutazione • Interazioni (a, b, g) - db talassemia e varianti emoglobiniche • Altre modificazioni genetiche ed ambientali AM-tbmadc
Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli a-talassemici sullo MCV in soggetti portatori di b-talassemia MCV, fL HbA2, % HbA2, % aa/aa -a/aa aaND/aa -a/-a - -/aa aa/aa -a/aa aaND/aa -a/-a - -/aa (R. Galanello, 2002) AM-tbmadc
Varianti emoglobiniche e sindromi talassemiche • Varianti emoglobiniche (2002) 845(erano 202 nel 1976) • Mutazioni talassemiche 336(4,5 % eterozigoti = 250.000.000 world-wide) • Emoglobinopatie con fenotipo talassemico 43 AM-tbmadc
Problemi nello screening delle talassemie • Microcitosi con HbA2 normale • HbF elevate • HbA2 “borderline” AM-tbmadc
HbA2, senza b-talassemia HbA2, in presenza di b-talassemia Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di b-talassemia - condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus) - alleli b talassemici “silenti” -interazione tra d e b talassemia - a. sideropenica grave - associazione tra b-tal. ed una variante con mutazione sulle catene a AM-tbmadc
Hemoglobin and HbA2 in non-b and b-thalassemia trait with iron deficiency b-thal trait non b Galanello et al., 1981 AM-tbmadc
Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni b-talassemiche severe 0 1 2 3 4 5 6 7 mild silent HbA2 (%) (R. Galanello, 2002) - 101 CT IVS2- 844 CG IVS1-6 TC b° 39CT non b AM-tbmadc
Interazione debtalassemia MCV, fl 77 MCH, pg 25 HbA2, % 1.6 65 20 4.9 MCV, fl 67 MCH, pg 21 HbA2, % 3.3 a/b ratio 1.92 d+ cd 27 G T b° cd 6(-A) AM-tbmadc Family F.F.
HbF elevate db delezione - Hb F 9 – 20 %, sintesi catene a/b 1,6 – 2,4 HPFH • HbF 3-4 % (scarso significato) • HbF 16-20 % sintesi catene normale AM-tbmadc
Cause di aumento dell’HbF Acquisite Genetiche • b-talassemia • db-talassemia • HPFH • anemia congenita ipoplastica • Espansione eritropoietica trapianto di midollo emolisi acuta gravidanza • Associata con tumori ematopoietici leucemia juvenile cronica mielogena altri disordini mieloproliferativi sindromi preleucemiche • Farmacologica 5-Aza HU Epo Butirrati Altri grassi a catena corta AM-tbmadc
Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta b IVSI nt 6 b 6 b IVSI nt 1 b IVSI nt 110 WT b 39 +27 b IVSII 844 b IVSII nt 1 b -92 b -87 b -101 AM-tbmadc
Terapia molecolare • Terapia genica farmacologica (gene g) • idrossiurea • acido butirrico • Trapianto genico (terapia genica somatica) • trasfezione gene b-globinico normale • vettore retrovirale • murine leukemia • Lentivirus • Manipolazione dello “switch” AM-tbmadc
Danno ossidativo • HbO2 MetHb • Globine a o b Emicromi corpi di inclusione legame alle membrane degradazione eme ROS perossidazione lipida + GSH¯ + MDA + esposizione PS emolisi • Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli AM-tbmadc
Pathways coinvolte nel danno alle membrane degli eritrociti in α e β talassemia AM-tbmadc Weatherall DJ, 1998
Prodotti di degradazione delle catene globiniche: • Globina • Eme • Emina (forma ossidata dell’eme) • Fe libero FORMAZIONE DI ROS (reactive oxygen species) AM-tbmadc
ROS (reactive oxygen species) Gutteridge JMC, 1995 Danni a organelli intracellulari, proteine (banda 4.1) e lipidi di membrana AM-tbmadc
Meccanismi di perossidazione lipidica AM-tbmadc Gutteridge JMC, 1995
Meral A et al. 2000 In pazienti affetti da talassemia si riscontra un aumento significativo di TBARS e CD, markers di perossidazione lipidica… AM-tbmadc
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (1/2) ------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione ------------------------------------------------------------------------------------------------- 1) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia a68 Asn ->Lys 2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S ridotta solub. (omozigote) b6 Glu ->Val 3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol ridotta solub. contatti subun. b67 Val ->Asp 4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park b92 His -> Tyr AM-tbmadc
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (2/2) ------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione ------------------------------------------------------------------------------------------------- 5) Aumentata Contatto a1b2 Eritrocitosi Hb Chesapeake affinità O2 C-terminale ba92 Arg -> Leu 6) Diminuita Eme/a1b2 Cianosi Hb Kansas affinità O2b102 Asn ->Thr 7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant catene a C-terminale a talassemico Spring (a+31) 8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore catene bb talassemico AM-tbmadc
Drepanocitosi (anemia falciforme) AM-tbmadc
Fenotipo anemia falciforme(anemia emolitica cronica + crisi vaso-occlusive) • Periostite metacarpale piede-mano • Osteonecrosi della testa del femore • Infarto cerebrale • Sindrome acuta-toracica • Retinopatie • Epatopatie • Ipostenuria da lesione midollare renale • Ulcere malleolari • Sequestrazione splenica • Infezioni gravi da germi capsulati (pneumococco) AM-tbmadc
Correlazione genotipo-fenotiponell’anemia falciforme • Genotipo al locus b • HbS/HbC • HbS/b-talassemia • Geni modificatori • HbF (cromosoma X e 6) • Aplotipi b-globinici Benin, Senegal, Bantù, Centro-Africa, Arabo-Indiano Polimorfismo C->T in -158 gG (HbF più elevata) • a-talassemia AM-tbmadc