La industria láctea y los bacteriofagos: tópicos de interés actual

1. La industria láctea y los bacteriofagos: tópicos de interés actual Andrea Quiberoni Workshop de Agroalimentos, Centro Binacional Argentino Uruguayo en Agroalimentos Buenos Aires, 25 y 26 de octubre de 2012

2. Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET) QUÍMICA Y BIOQUÍMICA • Bacterias probióticas • Dr. Jorge Reinheimer • Fagos en la industria láctea MICROBIOLOGÍA TECNOLOGÍA

3. Bacteriofagos Industria fermentativa La bioconversión de sustratos en compuestos de mayor valor agregado es el proceso básico de una amplia variedad de industrias • Las bacterias representan el pilar fundamental de los procesos • Cualquier población bacteriana es susceptible a infecciones fágicas • La mayoría de las industrias fermentativas experimentan contaminaciones fágicas • Graves consecuencias de estas infecciones para todos los sectores industriales(elevados costos y tiempo para identificar el origen e implementar medidas correctivas)

4. Infecciones fágicas en la industria fermentativa (Emond & Moineau, 2007)

5. Infecciones fágicas en la industria fermentativa (Emond & Moineau, 2007)

6. Bacteriofagos Industria láctea fermentativa • Los grandes volúmenes de leche cruda procesados diariamente constituyen la vía principal de ingreso de fagos a las plantas • La elevada frecuencia de mutación es origen de creciente diversidad • Entre el 0,1 y el 10% de los batchs están comprometidos por las infecciones PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL PRÁCTICAMENTE INEVITABLE

7. Bacteriofagos Industria láctea fermentativa Se han aislado fagos específicos para todos los géneros de bacterias lácticas (BAL) que utiliza la industria BAL más ampliamente utilizada como starter (nivel mundial) Lactococcus Starters para elaboración de leches fermentadas y quesos Streptococcusthermophilus Starters para elaboración de quesos azules Leuconostoc Starters para elaboración de quesos duros y leches fermentadas Lactobacillus (incluye especies probióticas)

8. Células de Lactobacillussp. infectadas por un fago 90 min después de la infección Lisis celular

9. Acidificación en leche: Lb. helveticus en presencia de fagos Fallas en el proceso de acidificación Ausencia de cultivos lácticos y probióticos CONSECUENCIAS

10. Bacteriofagos Industria láctea fermentativa LECHES FERMENTADAS QUESERÍAS • Calentamiento suave de la materia prima (63°C, 72°C), • Numerosas etapas (utensilios, operarios), • Separación de suero y generación de bioaerosoles. • Calentamiento de la leche a mayor temperatura (90°C), • Proceso relativamente aséptico, • Ausencia de drenaje y circulación de suero. FAGOS FAGOS RUPTURA DE BARRERAS FÍSICAS CULTIVOS INICIADORES CULTIVOS INICIADORES LECHE CRUDA BAJA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS

11. Bacteriofagos Industria láctea fermentativa FAGOS PRODUCTOS LÁCTEOS PROBIÓTICOS • Procesos altamente controlados (microbiológica y tecnológicamente), • Empleo de cepas ‘únicas’ y especializadas, • Importantes inversiones en I+D. ¿VÍAS DE INGRESO? ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS

12. Los bacteriofagos en la industria láctea Estrategias para disminuir el riesgo de infecciones Empleo de cultivos multicepa Empleo de medios inhibidores de fagos (PIM) Programas de rotación de cultivos Fermentaciones lácticas Higiene y diseño de la planta Tratamientos térmicos de la materia prima Empleo de cepas con fagorresistencia mejorada Empleo de cultivos de inoculación directa

13. Bacteriofagos Industria láctea fermentativa 1. Mejoramiento de la fagorresistencia de cepas a través de herramientas naturales 2. Termorresistencia extrema de fagos: implicancias tecnológicas y analíticas 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos 4. Inactivación fágica: diseño de nuevas tecnologías 5. Secuenciación genómica y proteómica

14. GRUPO DE TRABAJO Mag. Viviana Suárez Dra. Ma. Luján Capra Dra. Daniela Guglielmotti Dr. Diego Mercanti Ing. Mariángeles Briggiler Marcó Lic. Silvina Pujato Dr. Jorge Reinheimer Dra. Andrea Quiberoni Prof. Hans-Wolfgang Ackermann Prof. Sylvain Moineau Prof. Horst Neve Prof. Zeynep Atamer Dr. Orlando Alfano Tec. Antonio Negro

15. 1. Mejoramiento de la fagorresistencia • Empleo de herramientas naturales OBJETIVOS Lb. casei / paracasei Aislar mutantes espontáneos fagorresistentes (idénticas propiedades a la cepa madre) para su uso como fermentos en la elaboración de productos lácteos. (Capra et al. 2011) Lb. delbrueckii (Guglielmotti et al. 2006) S. thermophilus (Binetti et al. 2007) RESULTADOS Lb. helveticus • Variantes útiles, sin restricciones legales. • Interesantes candidatos para elaboración de productos lácteos probióticos (“strain claims”). (Quiberoni et al. 1998) Lb. plantarum (Briggiler Marcó et al. 2011)

16. 2. Termorresistencia extrema de fagos • Implicancias tecnológicas y analíticas Lactobacillus Leuconostoc (Capra et al. 2009, Mercanti et al. 2011) (Atamer et al. 2011) Aumento y diversificación de poblaciones fágicas que resisten los tratamientos térmicos Lactococcuslactis Streptococcusthermophilus (Suárez and Reinheimer 2002, Müller-Merbach et al. 2005, Atamer et al. 2009 (Binetti et al. 2000)

17. 2. Termorresistencia extrema de fagos • Implicancias tecnológicas y analíticas ANALÍTICAS TECNOLÓGICAS • Muestras conteniendo elevados niveles de fagos, • Mayor frecuencia de aislamiento de fagos termorresistentes, • Inconvenientes durante los análisis de laboratorio. • Fagos vehiculizados en la leche cruda(101-104 UFP/ml), • Fagos que resisten los tratamientos térmicos, • Contaminación del ambiente (planta, laboratorios) y de productos. TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS PARA DESINFECCIÓN ACTUALIZACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS

18. 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos Lb. johnsonii Lb. casei / paracasei (Ventura et al. 2003; Denou et al. 2008) (Lo et al. 2005; Ventura et al. 2006; Capra et al. 2008) Estudios moleculares de estas especies demostraron que los profagos son muy frecuentes Lb. rhamosus Lb. plantarum (Brandt & Alatossava 2003; Durmaz et al. 2008) (Ventura et al. 2003) Lb. gasseri (Ventura et al. 2006)

19. 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos PROFAGOS EN BACTERIAS PROBIÓTICAS • No se consideran entidades inertes en el cromosoma bacteriano • Fagos virulentos en ambientes industriales • Cepas hospedadoras lisógenas • Estudios para dilucidar su rol en la evolución de • Equilibrio del ecosistema intestinal ¿Antagonistas de los efectos benéficos? ¿Co-responsables de los efectos benéficos? (Lepage et al., 2008;Alemayehu et al. 2009)

20. 4. Inactivación fágica • Diseño de nuevas tecnologías • La fotocatálisis (UV/TiO2) es una alternativa atractiva para la desinfección del aire ambiental • Potencialidad de inactivación viral en bioaerosoles(principal via de dispersión de fagos en el ambiente industrial) POTENCIALIDAD DE APLICACIÓN • Tecnología eficiente y segura(UV-A) • Inactivación de una amplia diversidad de fagos • Posibilidad de aplicación continua en ambientes de planta y laboratorio INVESTIGACIONES EN CURSO • Mecanismos de inactivación fágica Equipos para purificación de aire • Ensayo de un prototipo a escala de laboratorio • Diseño y adaptación de equipos para uso industrial

21. 5. Secuenciación genómica y proteómica OBJETIVOS Aumentar el conocimiento sobre diversidad y evolución para fagos de bacterias lácticas y probióticas Lb. casei / paracasei Lb.plantarum (Briggiler Marcó et al., 2012)

22. Entidades biológicas más abundantes sobre el planeta (1030 – 1032 partículas fágicas) Pool de agentes biológicos con potencialidad inexplorada Los bacteriofagos REGULACIÓN DE POBLACIONES BACTERIANAS EVOLUCIÓN DEL PLANETA