Sejt-aggregációs kultúrák

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 15. Előadás Sejt-aggregációs kultúrák

3. Aggregációs sejtkultúrák • Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat • Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

4. Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához • Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellularadhesionmolecule) jelenléte a sejtfelszínen • Mátrix vagy mesterséges összetapadást segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

5. Sejtadhézió Sejt-sejt interakciók Oldott állapotú ECM Kadherinek Integrinek Sejt-mátrix interakciók Statikus ECM

6. A sejt-aggregáció kialakításának módszerei Aggregáció alacsony tapadóképességű anyagokhoz Aggregációscaffoldokon vagy kémiailag módosított felszínű anyagokon Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban Aggregációbioreaktorokban Aggregáció gravitációs kultúrákban

7. Gravitációs sejtkultúrák • A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben • Gravitációs kultúrák típusai: • Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban • Függőcsepp-kutúrák • Centrifugált aggregátumok

8. Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák • Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz • A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében • A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petri-csészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

9. Aggregáció forgó bioreaktorokban Forgó bioreaktor Sejtszuszpenziókhoz Forgó bioreaktor Adherens sejtekhez Gravitációs erő Gravitációs erő Mintavevő nyílások Töltőnyílás Mintavevő nyílások Forgásirány Forgásirány Töltőnyílás NG LSMMG

10. Bioreaktorok és sejt-aggregáció • Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok: • High aspect rotation vessel (HARV) • Slow turning lateral vessel (STLV) • Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

11. Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban

12. Sejt-aggregátumok felhasználása

13. Microgravitációs sejtkultúra – FüggőcseppI. A mintát kaccsal a fedőlemezre helyezzük Vazelin Vájt tárgylemez 180° Olajcsepp

14. Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II. Idő (napok) 0 180° 180° 180° 2 5 Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás megkezdődik

15. Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek 40 mm 150 mm

16. Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez • Az alacsony adherenciájú felszín segíti a szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását • A sejt-sejt kapcsolatok növekednek • Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel) borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

17. Természetes aggregáció Májsejt HGF-R EGF-R Integrin Egyéb Fas Epevezeték PVLApotenciálisan jól használható mesterségesmáj kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén E-Kadherin ASGP-R PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid) Sejtalak szabályozása Szferoid kialakulása A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója +EGF Kitapadás Lekerekedés Szferoid Májsejtek ASGP-Ralacsony gyors proliferáció Májsejtek ASGP-Rmagas lassú proliferáció 1mg/mlPVLA bevonat 100 mg/mlPVLA bevonat 100 mg/ml PVLA-val borított edény 15-20 ng/ml PVLA-val borított edény PVLA bevonat koncentrációja

18. Sejtaggregációserkentése mesterséges módszerekkel • Polimerből álló híd képzése a sejtek között. • Típusok: • Természetes adhéziós molekula • ECM-eredetűmolekula része • Polimer mátrix

19. Mesterséges sejt-aggregáció Bifunkcionálispolimer Sejtek Aggregálódott sejtek

20. Sejtek keresztkötése biotinnal Biotin hidrazid Avidin Sejtaggregátum Perjodát-funkcionalizált sejtek

21. Felszínek kémiai módosítása • Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810kDa) • Kémiailag módosított PEG (polietilénglikol) • Laktonnal módosított eudragit • PLGA nanogyöngyök • Lektinek és származékaik

22. Chitosan

23. Kémiailag módosított PEG MA(PEG)n Methyl-PEGn-Amine Methyl-(#ethyleneglycol) amine H2N O O O O CH3 MA(PEG)8 M.W. 383.48 Spacerarm 29.7 Å MA(PEG)12 M.W. 559.69 Spacerarm 43.9 Å MA(PEG)24 M.W. 1088.32 Spacer arm 86.1 Å [ ]8 [ ]12 [ ]24 CH3 CH3 CH3 O O O H2N H2N H2N

24. Lakton-módosítotteudragit Ellenionok + + + + - - - - - + + + + - - COO- Ko-ionok COOH COOH COO- HOOC pH > 6 -OOC COOH -OOC COO- HOOC COOH COO-

25. PLGA nanogyöngyök Diszperziós fázis Magasnyomású víz kifolyás Pumpa Oldott polimer (PLGA) Előkeverés Pumpa Mágneses keverő Magasnyomású víz befolyás

26. Lektinek és származékaik I. • A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek • A lektinek, vagy fitohemagglutininek(PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikussem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül • Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére

27. Lektinek és származékaik II. • Hat lektin család ismeretes:   • Legumelektinek (a pillangósvirágúak családjában) • Gabona-eredetű lektinek, • P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék) • A pentraxinok (állati fehérjék)  • A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok.  • A lektinekszénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetil-neraminsav. • Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket. • A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

28. A lektinek által felismert N-glikánok típusai

29. Sejt-aggregációscaffoldokon • Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja • Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

30. Nanoszerkezetűscaffold-ok • Spontán összeszerelődő scaffold-ok • Nanokompozit anyagok • Nanoszálak

31. Nanoszerkezetű anyagok felhasználása

32. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 16. Előadás Szövetek nyomtatása

33. A szövetnyomtatás alapjai • Scaffoldmentes konstrukció • Tisztított sejtek aggregált halmazait alkalmazzák • A sejthalmazokból áll a „biotinta” • A 3D szövetkonstrukciók felépítése a sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

34. Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká I.

35. Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká II. Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchimafragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká egyesülnek

36. Szervek nyomtatása • 3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet. • Szövetnyomtatás típusok: • Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális carcinoma) • Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és kortikális neuronok)

37. Az első szövetnyomtató

38. Érett, szervspecifikusprimer sejtek I. Sejtkultúra Biopszia Tisztítás TE-ben használható sejtek

39. Érett, szervspecifikusprimer sejtek II. Tisztítás TE-ben használható sejtek Szövetspecifikus rezidens őssejtek Biopszia Sejtkultúrák Differenciálódott szöveti sejtek

40. Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára • Forrás: biopszia vagy reszekció • Tisztítás • Expanzió in vitro tenyésztés során • Újradifferenciáltatás

41. Vérerek képzése szöveti nyomtatással Fontos a megfelelő nyomóerő alkalmazása

42. TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása • Koszorúér betegség, bypass készítése • Trombózis kezelése • Baleseti érsérülés • Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-vel