520 likes | 2.12k Views
Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain). Principes généraux. Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps
E N D
Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain)
Principes généraux • Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps • On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique • Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)
Les anticorps primaires(ou spécifiques) • Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché • Il en existe deux types : • Les AC polyclonaux • Les AC monoclonaux
ANTICORPS POLYCLONAUX Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés
ANTICORPS MONOCLONAUX Technique des hybridomes
Milieu HAT • Hypoxanthine • Aminoptérine • Thymidine • L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome
Anticorps • Polyclonaux : Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot Avantages : 1) coût généralement moins élevé 2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense • Monoclonaux : • - spécificité définie • - cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes
Antigènes masqués par la fixation • Restauration antigénique • Chauffage des coupes histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes) • Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé
2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE - ANTICORPS Immunofluorescence
Immunofluorescence directe fluorochrome
Immunofluorescence à deux étages fluorochrome
Fluorochrome Fluorochrome Immunofluorescence : Résumé INDIRECTE DIRECTE Cryocut Sérums utilisés Dépôts des sérums sur lames Incubation en chambre humide
Anticorps primaire conjugué péroxydase
Application (méthode streptavidine-biotine) • Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation • Préparation des Coupes En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)
Application (méthode streptavidine-biotine) • Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase »
Résumé du protocole Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Streptavidine-peroxydase Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames
Polymères • Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse »
Résumé polymère (Kit EnVision) Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes Étape 2 : Anticorps primaire Étape 5 : Contre coloration à l’hématoxyline Incubation Étape 3 : Polymère marqué à la HRP Étape 4 : Substrat chromogène
Technique de double marquage en microscopie optique On doit utiliser deux enzymes différentes
IF / IHC IMMUNO-FLUORESCENCE : Avantage : faible coût et technique facile et rapide mais - ne permet pas la conservation des lames - peu informative sur la morphologie IMMUNO-HISTOCHIMIE : - permet d’apprécier la morphologie des lésion - permet la conservation des lames
HMB 45Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique) Chromogène : fast red
Difficultés liées à la technique Fluorescence : - découplage du fluorochrome (bruit de fond) (=> diminution bruit de fond par Bleu Evans) - fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…) - fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus) - fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites) - « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)
Difficultés liées à la technique IHC : - peroxydases endogènes - biotines endogènes - zones de nécrose - absorption passive (histiocytes)
Difficulté non liée à la technique • un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées) • CD 10 (cALLA) et cellules du rein • CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines