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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE. Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives) permet le conseil génétique diagnostic des femmes porteuses Diagnostic prénatal Diagnostic préimplantatoire Diagnostic prédictif.
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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE • Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude • Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives) • permet le conseil génétique • diagnostic des femmes porteuses • Diagnostic prénatal • Diagnostic préimplantatoire • Diagnostic prédictif
COMPLEXITE DU CHAMP D’APPLICATION • Très nombreuses maladies génétiques – très nombreux gènes • Phénotypes parfois mal définis • Anomalies spécifiques d’une maladie – Stratégies d’étude spécifiques • Capacité de réponse d’un patient à une molécule thérapeutique : • Phamacogénétique
Méthodes utilisées pour le diagnostic génotypique DIAGNOSTIC DIRECT 1 – Recherche de mutations ponctuelles - mutation connue - screening d’un gène : séquençage, DHPLC, HRM 2 – Recherche d’amplifications de triplets 3 - Recherche de délétions DIAGNOSTIC INDIRECT
Dans un microtube : • ADN à amplifier ou • matrice : 50ng à 500ng • les 2 amorces • -dNTP • -Taq Polymérase • -tampon avec Mg++ • Volume final : 20 l à 100 l • Appareil : Thermocycler
1– recherche directe de la mutation déjà identifiée dans la famille A–PCR - restriction
B – ASO Allele specific oligonucleotide 1 - PCR + DOT BLOT (dépôt sur membrane) 2 - hybridation par oligosondes spécifiques de la séquence normale de la séquence mutée
The line-probe assay (LiPA) Biotinilated primer
C – ARMS test ou allele specific PCR
D– test OLA PEO : Penthaethylene oxide units marquage fluorescent FAM HEX TET • La sonde commune peut être marquée avec un fluochrome différent dans les PCR multiplex • - Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente
Oligonucleotide ligation assay OLA Application de la technique OLA à la recherche des principales mutations du gène CFTR (mucoviscidose)
2 – recherche de mutations dans un gène : screening • Séquençage • DHPLC • HRM
Séquençage 4 mélanges sont préparés: - le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase (vecteur)
L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence
DHPLC Dans des conditions de dénaturation partielle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les homoduplexes et les hétéroduplexes.
HRM Après PCR en présence d’un intercalant fluorescent cette technique permet, en appliquant une montée en T° très progressive, de discriminer des variants. La dénaturation provoque la baisse de la fluorescence puis son extinction quand la dénaturation est complète. Chaque séquence a donc une courbe de fusion qui lui est propre. Une modification de cette courbe signale la présence d’une anomalie.
2 – Recherche d’amplifications de triplets Exemple du X Fragile - par PCR • Possibilité d’amplifier jusqu’à 80 répétitions • Hommes - si > 80répétitions = pas de signal • femmes – un seul signal = sujet homozygote • ou sujet présentant une • mutation complète
Par Southern blot EagI EcoRI FMR1 EcoRI (CGG)50 sonde EagI EcoRI FMR1 EcoRI (CGG)500 sonde
Coupure EcoRI + EagI et SOUTHERN BLOT N N PM PM MT MT MUTE PREMUTE X INACTIF NORMAL X INACTIF 5,2 kb PREMUTEX ACTIF 2,8 kb NORMAL X ACTIF
3- Recherche de délétions 2-1 Délétions de petite taille PCR simple ou multiplex Southern MLPA QMPSF 2-2 Délétions des télomères : MLPA 3-3 Délétions de grande taille : CGH array
Recherche de délétions par PCR multiplex Exemple de la myopathie de Duchenne et de Becker
Primer design Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions Control Patient 1A 1B ZIC2 TGIF SIX3 SHH SHH Ctrl gene SHH SIX3 TGIF ZIC2 2A 2B stabilization Forward primer Reverse primer stabilization tail+6FAM Target specific sequences tail Control - Patient PCR 1A 1B 2A 2B Denaturation Target 1 fragment Target 2fragment Fragment Analysis QMPSFQuantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments • Peak size normalization based on endogenous peak of control gene • Visual analysis
MLPA (1)Multiplex Ligation dependant PCR Amplification Probe design Synthetic oligonucleotide M13 derived oligonucleotide 1A 1B Control 2A 2B Primer XTarget specificStufferPrimer Y binding sitesequences sequencebinding site Patient Multiplex hybridization and ligation No ligation of mismatched probes 1A 2A 1B 1B 2A 2B Target 1 Target 1 Target 2 PCR with universal primers X and Y No exponential amplification of non ligated probes XY • Peak size normalization • Ratio = R = 1.5 duplication R = 1 normal R = 0.5 deletion Patient peak Control peak Fragment Analysis
DIAGNOSTIC INDIRECT • INDICATIONS • - gène localisé dans le génome mais non cloné • gène connu, mais mutation non identifiée • exemple de la myopathie : recherche des filles vectrices • délétion non détectable chez les filles (sauf PCRq) • PRINCIPE • identification du chromosome porteur du gène muté à l’aide • de marqueurs polymorphiques situés à proximité du gène • - liaison génétique • CONTRAINTES • - disposer d’un enfant atteint • risque de recombinaison
Liaison génétique A1 A3 B2 B4 Gène N Gène M C2 C3 D4 D1 A1 B4 Gène M C3 D4
Allèle 1 Allèle 2 2 -2 1 -1 1 -2 1 -2