Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012

1. Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012

2. Jak najít v genomu SSR? • stále obvykle není reálné osekvenovat a projít celý eukar. genom a najít (relativně vzácné) SSR lokusy • účinnější je sekvenovat úseky kde se dá předpokládat vyšší výskyt SSR → snaha o vytvoření ´SSR-enriched genomic library´ • sekvenací fragmentů DNA genom. library

3. Vytvoření SSR-enriched genomic library štěpení genom. DNA na fragmenty, jejich úprava aby šly použít pro běžné molek. metody - PCR amplifikace a sekvenace (~300-1000 bp) SSR enrichment:pomocí sondy komplementární k určitému SSR motivu se vytáhnou fragmenty obsahující daný SSR motiv výsledné fragmenty jsou sekvenovány, na základě získaných sekvencí navrženy primery pro daný SSR lokus

4. Vytvoření SSR-enriched genomic library • štěpení genom. DNA • blunt-ends; 16 h inkubace, pak purifikace (PCR Clean-up kit) ← OK + restr. enzym • ligace: na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a sekvenaci; 20 h inkubace dimery linkerů → + T4 ligáza, linkery • ověření úspěšnosti ligace: PCR, linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear bez proužku dimerů linkerů

5. Vytvoření SSR-enriched genomic library • SSR-enrichment - hybridizace: • na fragmenty se annealuje sonda (primer) se SSR motivem, která je na 5´ konci značená biotinem; ca 60° - 15 h teplotní denaturace + sonda

6. Vytvoření SSR-enriched genomic library • SSR-enrichment – streptavidin capture, wash: • ke směsi se přidají streptavidin-coated magnetic beads: vážou biotin a navázáním na sondu z roztoku vychytají fragmenty které nesou daný SSR motiv + roztok streptavidin-coated beads separace magnetem odsátí roztoku • magnetické kuličky s cílovými fragmenty se separují pomocí magnet. stojánku, promývají a supernatant se odstraní • cílové DNA fragmenty se uvolní TE pufrem (95°), pomnoží pomocí PCR: linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear fragmentů 300-800 bp→ azpurifikují PCR Clean-Up kitem

7. Co dál s SSR-enriched genomic library? • klasická sekvenace (Sanger): • umožňuje sekvenaci pouze u směsi homogenních molekul • knihovnu nutné nejdříve amplifikovat pomocí PCR – primery nasedají na linkery naligované na koncích fragmentů • PCR produkt klonován, aby se separovaly jednotlivé molekuly PCR produktu, a klony potom sekvenovány – finančně extrémně náročné! • obvykle pouze 5-10% fragmentů opravdu nese SSR!!! • př.: nutné sekvenovat ca 100-200 klonů pro získání 10 SSR lokusů =14-28 tis. Kč • možná úspora: selekce klonů pomocí Southern blottu – jako sonda použitý opět daný SSR motiv; sekvenovány pouze klony u nichž blotting opravdu prokáže přítomnost SSR

8. Co dál s SSR-enriched genomic library? • 454 pyrosequencing • umožňuje i sekvenaci směsi heterogenních molekul (není nutné klonování) 1 molecule → 1 sequencing read 1 sample: min. 5,000-8,000 seq. reads / 2500 Kč(vlastní cena chemikálií, u komerčních firem několikrát víc) • nevýhody: • kratší délka 454 sekvencí (<550 bp) → riziko že se nepodaří najít vhodná místa pro primery → redukuje počet reálných SSR lokusů • minimální cena 1 runu je ca 30 tis. Kč (= vyplatí se multiplexovat víc vzorků, v jednom runu možné kombinovat až 12 vz., tj. náklady na 1 vzorek ca 2500 Kč)

9. Praktika Mikrosat. praktika, 16.-20.4. + 14.-18.5. • restrikce genomové DNA • ligace adaptorů • hybridizace daného SSR motivu (motivů) • amplifikace a purifikace enriched SSR library 454 sekvenování na GS Junior (Roche/454), ~ konec května: • sekvenace vytvořené SSR library, 2 dny pipetování (+ 3. den stažení dat z přístroje)