1 / 44

Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s histološkim nalazom i HPV statusom. Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med. RAK VRATA MATERNICE.

kuniko
Download Presentation

Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJEKi-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s histološkim nalazom i HPV statusom Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

  2. RAK VRATA MATERNICE godišnje 400 000 novooboljelih i 250 000 smrtnih slučajeva drugi po učestalosti maligni tumor kod žena pojavnost: - razvijene zemlje 10/100 000 (na 10. mjestu kod žena)- zemlje u razvoju 19/100 000 (najčešći!)- Hrvatska 13,7/100 000 (na 8. mjestu kod žena)

  3. CIN 1 CIN 2 CIN 3 CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN) poremećaj stanične zrelosti i orijentacije i nuklearne atipije bojenje H-E klasifikacija s obzirom na debljinu zahvaćenog epitela

  4. CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN) NEDOSTACI PATOHISTOLOŠKE KLASIFIKACIJE: podložna subjektivnosti patologa ne uzima u obzir dinamiku procesa (progresija, regresija) razlikovanje reaktivnih promjena

  5. HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV) preinvazivne promjene i invazivni rak vrata maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim papiloma virusom HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata maternice Walboomers et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.J Pathol 1999;189:12–9.

  6. HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV) oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa može inficirati spolni sustav žene tipovi visokog onkogenog rizika su značajno povezani s progresijom u invazivni rak vrata maternice u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, 58, odnosno 39, 45, 59, 68 Bosch et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802. Chan et al. Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.

  7. cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)

  8. cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza • 3 regije: - rana regija - kasna regija - regulatorna regija HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)

  9. cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza • 3 regije: - rana regija - kasna regija - regulatorna regija • rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikaciju • E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusa HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)

  10. cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza • 3 regije: - rana regija - kasna regija - regulatorna regija • rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikaciju • E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusa • kasna regija: L1 i L2 - daju kod za bjelančevine virusne kapside HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)

  11. HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV) • HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb • vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija

  12. HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV) • HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb • vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija • hipofosforilirani pRb vezujući E2F ne dozvoljava prijelaz stanice iz G1 u S fazu i staničnu replikaciju • hiperfosforilirani pRb oslobađa E2F

  13. fosforilacija se događa tako da se na pRb veže kompleks ciklina i ciklin ovisnih kinaza • aktivnost ciklin ovisnih kinaza (CDK) reguliraju njihovi inhibitori – CDK inhibitori • p16INK4a - ekspresija je regulirana negativnom povratnom spregom od strane pRb •  • inaktivacija pRb preko HPV E7 negativnom povratnom spregom dovodi do pojačanja djelovanja p16INK4a biomarker ekspresije HPV onkogena u stanicama • Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73. • Wang et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:1355-60. HPV  p16 INK4a

  14. životni vijek normalnih stanica cervikalnog epitela: četiri do pet dana • u displastičnom epitelu je izmjena stanica ubrzana (CIN 3 - 12 sati) • Ki-67 antigen je biomarker stanične proliferacije • stupanj proliferacije cervikalnog epitela određen imunohistokemijskim bojanjem s Ki-67 protutijelom korelira sa stupnjem cervikalne displazije • Kruse et al. J Pathol 2001;193:48-54. • Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73. • Zanotti et al. Gynecol Oncol 2003;89:376-84. CIN  Ki-67

  15. onkogeni HPV tipovi •  • regulatorne i replikatorne promjene staničnog ciklusa • + • genetska nestabilnost •  • DNA oštećenja  aneuploidija • Hanselaar et al. DNA changes in progressive cervical intraepithelial neoplasia.Anal Cell Pathol 1992;4:315-24. HPV  DNA

  16. aneuploidije su povezane sa skvamoznim intraepitelnim lezijama (SIL) visokog stupnja i s integracijom HPV genoma • Rihet et al. J Clin Pathol 1996;49:892-6. • aneuploidija se javlja u visokorizičnih HPV pozitivnih skvamoznih intraepitelnih lezija, dok se u niskorizičnih HPV pozitivnih SIL i u HPV negativnih SIL ne javlja • Bollmann et al. Cancer 2003;99:57-62. • aneuploidija je rizični čimbenik za progresiju CIN-a 1 i 2 u CIN 3 • Melsheimer et al. Cytometry 2001;46:166-71. CIN  aneuploidija

  17. patohistološka analiza cervikalne biopsije ovisi o subjektivnoj procjeni patologa i zbog toga je podložna greškama • različiti imunohistokemijski biljezi bili su istraživani s obzirom na njihovu specifičnost da označe displastične ili neoplastične stanice - proliferacijski antigen Ki-67 - inhibitor ciklin ovisnih kinaza p16INK4a • aneuploidija se povezuje sa CIN-om visokog stupnja i progresijom intraepitelne lezije 2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

  18. u nijednom dosadašnjem istraživanju nije istražena moguća korist od istovremenog određivanja Ki-67, p16INK4a i DNA aneuploidije • u većini dosadašnjih istraživanja registrirana je samo prisutnost Ki-67 pozitivnih stanica u gornje 2/3 epitela  točnije je kvantitativno određivanje tih stanica u odnosu na visinu epitela • Kruse et al. Ki-67 immunoquantitation in cervical intraepithelial neoplasia (CIN): a sensitive marker for grading. J Pathol 2001;193:48-54. 2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

  19. 2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA • Preliminarni rezultati našeg istraživanja:- značajne razlike u broju Ki-67 pozitivnih stanica izmeđurazličitih stupnjeva cervikalne displazije

  20. Preliminarni rezultati našeg istraživanja: • - značajne razlike u učestalosti Ki-67 pozitivnih stanica u pojedinim trećinama cervikalnog epitela kod različitih stupnjeva displazije 2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

  21. 2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

  22. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

  23. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju • Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

  24. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju • Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika • Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije. 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

  25. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju • Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika • Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije. • Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja. 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

  26. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju • Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika • Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije. • Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja. • Utvrditi da li se istovremenim određivanjem i kombinacijom različitih biljega mogu postići točniji rezultati u dijagnostici cervikalne intraepitelne neoplazije, odnosno u razdvajanju CIN-a 1 od CIN-a 2 i CIN-a 3 3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA

  27. očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1 4. HIPOTEZA

  28. očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1 • imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa 4. HIPOTEZA

  29. očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1 • imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa • u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a 4. HIPOTEZA

  30. očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1 • imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa • u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a • kombinacija više parametara (Ki-67, p16INK4a, DNA ploidija) bi trebala imati veću osjetljivost i specifičnost u odvajanju kako cervikalnih intraepitelnih neoplazija od normalnog nalaza, tako i unutar skupine CIN-a na CIN 1, CIN 2 i CIN 3 4. HIPOTEZA

  31. Uzorci tkiva s potvrđenom patohistološkom dijagnozom: - CIN 1 - normalno tkivo - CIN 2 - CIN 3 - karcinom cerviksa • Postupci: • - grupna tipizacija na HPV visokog i niskog rizika lančanom reakcijom polimeraze • - imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na antigen Ki-67 • - imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na protein p16INK4a • - protočna citometrija i određivanje DNA ploidije • Patolog koji vrši analizu nije upoznat kojoj skupini pripada pojedini uzorak 5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA

  32. Analizom uzoraka bojanih na Ki-67 antigen odrediti će se: - ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne membrane - postotak Ki-67 pozitivnih jezgara u svakoj trećini epitela • Analizom na p16INK4a smatrati će se pozitivnima uzorci sa više od 5% nuklearno ili citoplazmatski obojanih stanica • Protočnom citometrijom uzorci će se razvrstati u 3 skupine: 1.diploidni 2. aneuploidni 3. poliploidni 5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA

  33. 6.1. ISPITANICI • 30 uzoraka tkiva cerviksa za svaku dijagnostičku skupinu CIN-a • Kontrolne skupine: - normalno tkivo cerviksa pacijentica operiranih zbog drugih bolesti - uzorci tkiva invazivnog karcinoma cerviksa • Kriterij uključenja u istraživanje: patohistološka dijagnoza jasno definirana od strane patologa eksperta za ginekološku patologiju 6. METODE ISTRAŽIVANJA

  34. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.1. HISTOLOŠKA ANALIZA • fiksacija tkiva 24 h u 4% puferiranom formalinu • uklapanje u parafin • rezovi debljine 4 m • bojanje hemalaun-eozinom

  35. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA 6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen • protutijela na ljudski Ki-67 (mišje protutijelo M7240, DAKO, Glostrup, Danska) • obojanost staničnih jezgara Ki-67 antigenom kvantitativno će se odrediti koristeći Analysis Soft Imaging System, GmbH, Muenster, Germany • u svakom uzorku izabrati će se najreprezentivnije područje (s najvećim stupnjem CIN-a) izbjegavajući tangencijalno rezana područja

  36. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA 6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen • Kvantitativna analiza: - ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne membrane - postotak Ki-67 pozitivnih jezgara posebno u donjoj, srednjoj i gornjoj trećini epitela

  37. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA 6.2.2.2. Bojanje na protein p16INK4a • monoklonsko protutijelo za protein p16INK4a (CINtecTM p16INK4a citology kit, DAKO, Glostrup, Danska) • imunoreaktivnost na p16INK4a: - nalaz smeđe obojanosti jezgara i/ili citoplazmi, pri čemu će se pozitivnim nalazom smatra obojanost u više od 5% epitelnih stanica

  38. 6.2. POSTUPCI 6.2.3. HPV TIPIZACIJA LANČANOM REAKCIJOM POLIMERAZE • deparafinizacija tkivnih blokova - trostepeni postupak sa ksilolom i apsolutnim etanolom • izolacija DNA iz tkivnih blokova koristeći Nucleo Spin Tissue reagense (Machery-Nagel, Düren, Njemačka) • grupna tipizacija HPV-a u dvije posebne reakcije s dva para početnica, koristeći PCR Human Papilloma Virus Typing Set (TaKaRa, Shiga, Japan) • tipizacija na slijedeće genotipove: - 6, 11 - 16, 18, 31, 33, 52, 58 6. METODE ISTRAŽIVANJA

  39. 6.2. POSTUPCI 6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA • suspenzija stanica tumorskog tkiva za DNA analizu protočnom citometrijom pripremiti će se modificiranom metodom Hedley-a i sur. • DNA histogrami se analiziraju u računalnom programu Modfit 3.0 (Verity Software House, Inc.). • tumori s jednim G0/G1 vrškom se klasificiraju kao diploidni • tumori koji imaju i dodatni odvojeni G0/G1 vršak (s više od 10% jezgara) kao aneuplodni • tumori s tri ili više odvojena G0/G1 vrška su multiploidni 6. METODE ISTRAŽIVANJA

  40. 6.2. POSTUPCI 6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA • stupanj aneuploidije se izražava DNA indeksom koji predstavlja omjer relativnog G0/G1 DNA sadržaja populacije uzorka i referentnih diploidnih stanica • DNA indeks diploidnih stanica iznosi 0,95-1,05 • kod multiploidnih tumora koristit će se aneuploidna subpopulacija sa najvećim DNA indeksom • tetraploidni tumori su oni čiji DNA indeks iznosi 1,9-2,1 6. METODE ISTRAŽIVANJA

  41. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI • Statistica 7.1 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA) • χ2 test za nominalne podatke • Kolmogorov-Smirnov test za provjeru normalnosti raspodjele intervalnih vrijednosti • za intervalna mjerenja: - t-test i analiza varijance - neparametrijski testovi (Mann-Whitney U-test i Kruskal-Wallis test)

  42. 6. METODE ISTRAŽIVANJA 6.2. POSTUPCI 6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI • prognostička vrijednost pojedinih varijabli u odnosu na patohistološku dijagnozu ispitati će se logističkom regresijom • značajnom će se smatrati P < 0,050 • 30 uzoraka tkiva u svakoj ispitivanoj skupini (CIN 1, CIN 2 i CIN 3): - razina značajnosti od 0,050 - snaga istraživanja od 90%

  43. 7. ZNANSTVENI DOPRINOS • razlikovanje reaktivnih atipija cervikalnog epitela od cervikalnih intraepitelnih neoplazija • preciznije svrstavanje u podgrupe unutar skupine cervikalnih intraepitelnih neoplazija

  44. 8. KLINIČKI DOPRINOS

More Related