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Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS. Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP. Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações. Perda:

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  1. AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

  2. Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações • Perda: • deleção • monossomia • Ganho: • duplicação, amplificação trissomia, poliploidia • Relocação: • translocação • inversão • inserção

  3. CULTURA CELULAR E BANDA G 500 bandas Resolução: ~6milhões pb ~50genes/banda >4 Mb

  4. CITOGENÉTICA MOLECULAR • Pinkel et al. (1986):Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromos • Identificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadores • Detecção de alterações cromossômicas emnúcleos interfásicos • Estudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas

  5. TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR • FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação) • SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações) • M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) • CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos) • Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

  6. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTEFISH

  7. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE • FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

  8. DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica Sonda: segmento de DNA específico

  9. http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO

  10. ETAPAS Pré-tratamento: Ácido acético RNase e pepsina Desidratação Etanol Preparação da lâmina (DNA alvo) Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC Fluorocromos: Sondas FITC-fluoresceína (verde) Espectrum green ( verde) Rodamina (vermelho) Texas red (vermelho) Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight) Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio) Detecção da sonda e contracoloração:iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

  11. ETAPAS Material: -núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços -cromossomos metafásicos: cultura celular

  12. ETAPAS (Ácido acético, RNase, pepsina)

  13. ETAPAS Hibridização (câmera úmida à 37oc) Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

  14. TIPOS DE SONDAS • Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -sonda alfa-satélite (centromérica) -sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G) -sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y) -sonda telomérica (telômeros) • Sondas de cópia única ou locus específica • Sondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting

  15. TIPOS DE SONDAS

  16. TIPOS DE SONDAS

  17. SONDAS CENTROMÉRICAS Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

  18. SONDAS CENTROMÉRICAS gastrite:-7 gastrite:+7 APLICAÇÃO: aneuploidias em núcleos interfásicos úlcera:+8 Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

  19. SONDAS LOCUS ESPECÍFICA del (21q11.2) Diagnóstico de doenças com microdeleção

  20. SONDAS LOCUS ESPECÍFICA Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)

  21. SONDAS LOCUS ESPECÍFICA Adenocarcinoma gástrico: Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53(vermelho) 17(verde) Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

  22. SONDAS WCP – Cromossomo Total

  23. SONDAS WCP – Cromossomo Total Detecção de Translocação recíproca balanceada

  24. SONDAS WCP – Cromossomo Total A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

  25. SONDAS TELOMÉRICAS

  26. SONDAS TELOMÉRICAS Aplicação: -Deleções terminais -perdas teloméricas

  27. SONDAS TELOMÉRICAS (cromossomo 5)

  28. APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH Mapeamento de genes e sequências gênicas Estrutura e organização dos cromossomos Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções Identificação de alterações cromossômicas em esperma Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto) Diagnóstico de neoplasias

  29. APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

  30. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH • Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais • Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 dias • FISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

  31. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

  32. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH Normal Trissomia do 21 Triplo X

  33. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO 3 sinais vermelho: blastômero com trissomia do 21

  34. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS AMPLIFICAÇÃO GÊNICA CCND1, c-MYC, HER2/Neu TRANSLOCAÇÕES t(9,22); t(8;14) DELEÇÕES TP53 (17p13), RB (13q13)

  35. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica

  36. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

  37. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

  38. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

  39. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

  40. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Schrock et al., Science 273:494-497, 1996 Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

  41. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.

  42. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Classificação das cores pseudo-coloridas Cor capturada

  43. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Cromossomos marcadores Cariótipo normal

  44. A -6 -8 B -6 -8 Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC cell. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY t(1;16) t(5;9;13) t(6;8;15) t(6;7) t(6;15) t(11;19) Limitação: -Cultivo celular – metáfases -Não detecta deleções/duplicações e inversão

  45. CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas  várias homologias cromossômicas

  46. BANDAMENTO COLORIDOCROSS-SPECIES COLOR BANDING

  47. BANDAMENTO COLORIDO • Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano • Sondas: derivadas de primatas (gibões) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus:cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem • Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

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