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Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório. Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP. NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO. CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos)
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Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP
NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos) ~85% carcinomas CÂNCER GÁSTRICO: 2º tipo (mundo) 3º tipo Brasil (23.200 casos) ~95% adenocarcinomas
CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO ÁLCOOL E FUMO FATORES DE RISCO Ambiental e genéticos História familial Agentes infecciosos (HPV) Megaesôfago chagásico Esôfago de Barrett Lesões cáusticas Aneuploidias Mutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu
Doença de Chagas - Fase crônica Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas 2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso (megacólon) Coração Esôfago (megaesôfago) 80%
Risco de 3-8% Megaesôfago chagásico Carcinoma de células escamosas do esôfago • Complicação tardia mais séria do megaesôfago • 5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença • Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa estase alimentar aumento do crescimento bacteriano e irritação química esofagite crônica
C ARCINOMA DE ESÔFAGO Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago Esofagites crônicas Megaesôfago chagásico (MC) FISH: aneuploidias 7, 11, 17 deleção TP53 amplificação CCND1 Imuno: Expressão proteínas: p53, p16 e fhit Apoptose: caspase-3 ativada Proliferação celular: antígeno Ki-67 Molecular: Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento) T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa) CGH MC:60% aneuploidias (-7,+7, -17, +17) 54,5% deleção TP53 CE:100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1
CÂNCER GÁSTRICO • Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal • Brasil: Estimativas para 2006 (INCA) • 23.200 casos novos • Homens: 2x mais afetados
TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO • ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO: • Presença de lesões pré-neoplásicas • Predominante em homens e idosos • ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO: • Prognóstico pior • Não associado a lesões pré-cancerosas • Mais frequente em mulheres e jovens
Helicobacter pylori Lesões pré-cancerosas Predisposição Genética Gastrectomia Anterior Tabaco Lesões do DNA Álcool Alimentos salgados , enlatados e defumados CARCINOGÊNESE GÁSTRICA
Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000) • Prevalência da Hp: 40 a 50% na população • 9 vezes risco de câncer gástrico • Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA • Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas • Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑
+ + Estômago Normal Gastrite H.pylori Úlcera Gastrite atrófica Apoptose regulada Apoptose Apoptose Inflamação TNF CD95 NO Inflamação TNF CD95 NO Proliferação regulada Proliferação Proliferação ¯ Desequilíbrio (perda de células) Homeostase (renovação celular normal) Homeostase ( da proliferação celular) HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner et al., 1997)
CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO • Alterações genéticas e epigenéticas • Oncogenes • Genes supressores de tumor • Reguladores do ciclo celular • Moléculas de adesão celular (caderinas) • Genes de reparo do DNA • Instabilidade genética • Ativação de telomerases
PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOS Cromossomos Regiões Cromossômicas Genes 1 1p (1p36) ; 1q22-q31 p73 2 2pter-p23; 2q; 2q 3 3p14; 3q (3q12-qter) FHIT 4 4q32 5 5q21 APC 7 7pq; 7q22; 7q31 ERBB; EGFR, HGF; c-MET 8 8pq; 8q (8q23-24) c-MYC 9 9p (9p21) CDKN2A (p21) 12 12q (12q24) EPS8; DOC-1 13 13q (13q21-22) receptor de serotonina 14 14q (14q24) 15 15q (15q11-q15) 16 16pq, 16q22 E-Caderina 17 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) TP53, c-ERBB2, gastrina 18 18q21; 18q DCC 19 19p(19p13); 19q(19q13) 20 20pq; 20q11-q12 22 22q
CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO(modificado Tahara, 2004) INTESTINAL C-ERBB2 C-MET CICLINA E TP53 APC TP53 p27 D1S191 HIPERMETLAÇÃO MUCOSA NORMAL METAPLASIA INTESTINAL ADENOMA CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES LOH 1p36 (p73) LOH 7q p27 TELOMERASE hTERT H. pylori TELÔMEROS INSTABILIDADE GENÉTICA CD44 ALTERADO CICLINA E CD44 ALTERADO CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES MUCOSA NORMAL LOH 17q21 MUTAÇÃO/PERDA E CADERINA AMPLIFICAÇÃO K-SAM c-MET DIFUSO MUTAÇÃO/LOH TP53
Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico indicar marcadores cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica FISH -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene TP53, -amplificação CCND1 e Her-2/neu (c-erbb-2) lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástrico MOLECULAR Avaliação da H. pylori Polimorfismos: CYP, GST, XRCC1, XRCC3,COX2, NOS2 Expressão gênica: PCR Real Time RaSH (hibridação subtrativa rápida) Metilação IMUNO-HISTOQUÍMICA expressão das proteínas: -p53 -ciclina D1 e p185 (Her-2/neu) Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização utilizadas no diagnóstico precoce e prognóstico
MATERIAL • Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e H. pylori negativas • Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico) • 38 gastrites crônicas • 13 gastrites atróficas crônicas • 21 úlceras gástricas • 21 metaplasias intestinais • 20 adenocarcinomas gástricos
Gastrite crônica e gastrite atrófica associada com H. pylori precede a formação do câncer gástrico • Úlcera péptica maior risco de câncer gástrico • Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53. • Amostras: 38 gastrite crônica • 13 gastrite atrófica • 21 úlcera gástrica
Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%) Gastrite crônica: 8/38 casos -7, +7 75% Hp+ Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos +7, +8 100% Hp+ Deleção TP53: não observada Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%)
Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%) +7,+8; +17 69% Hp+ Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%)
GC: +7 GC: -7 UG: +8 ↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori)
Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal) • Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor. • Objetivo: • Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico.
60% (3/5) casos: deleção TP53 • 12% (2/17) casos: expressão p53 • 71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9 • Associação: aneuploidias x H. pylori
100% casos: aneuploidias (tri/tetra) • 30% (6/20 ): trissomias múltiplas • 3/3 casos: deleção TP53 • 80% (12/15): expressão p53
Metaplasia: +7 Adenocarcinoma +9; +17 adenocarcinoma Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53(vermelho) 17(verde)
AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS monossomias trissomias
IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53 Metaplasia p53+ (fraca) Mucosa normal p53- Adenocarcinoma p53+ (forte)
Cromossomos 7, 8, 9 e 17 carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular • 7q31: MET • 8q24: MYC • 9p21: CDKN2A • 17p13: TP53 • 17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU) • Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico alterações presentes em frequências adenocarcinoma conecção cronológica entre essas lesões expansão monoclonal • Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago Dosagem anormal e expressão gênica vantagem proliferativa
APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND EXPRESSIONS OF p53 • Apoptose: homeostase do tecido equilíbrio entre proliferação e morte celular programada • Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva potencializa o efeito de carcinógenos risco de câncer • Associação: H. pylori x Apoptose lesões gástricas ??? • H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico
OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e comparar com adenocarcinoma gástrico técnicas que detectam apoptose em fases diferentes: • Caspase-3 ativada (CPP32) mais precoce • TUNEL fragmentação do DNA • Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53 • AM0STRAS: 8 mucosa normal Hp- • 34 gastrite crônica • 11 gastrite atrófica • 17 úlcera gástrica • 12 adenocarcinomas
IA aumentados: TUNEL: GAC CPP32: GC Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso
Table 2 – Aneuploidy, TP53 gene deletion and expression, and clinicopathological data in chronic gastritis (CG), atrophic gastritis (CAG) and gastric ulcer (GU) cases. TUNEL CPP32 B A D C E F H G A-B:gastrite crônica C-D: úlcera gástrica E-F: metaplasia intestinal G-H: adenocarcinoma gástrico
CONCLUSÕES • Não houve associação entre apoptose aumentada e infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53 • não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas, • aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori reforçando a participação de lesões gástricas com potencial pré-canceroso na tumorigênese do estômago enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose.
Double minutes (DM) aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação) Aumento da expressão gênica→proteína Regiões homogeneamente coradas (HSR)
Carcinogênese: Genes Amplificados -CCND1 -c-MET -c-MYC -c-ERBB-2 (HER-2/NEU)
-40 carcinoma esôfago -12 mucosa normal -40 adenocarcinoma gástrico -14 mucosa normal Avaliar a relação entre amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico IMUNO Anticorpos: ciclina D1(nuclear) Her-2 (membrana) FISH Cyclin D1 (vermelho) Her-2 (vermelho) Centrômeros (verde)
AMPLIFICAÇÃO: CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40) câncer gástrico 10% (4/40) HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40) IMUNO: Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40) Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40)
FISH: (A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho)
FISH: (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico (C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico
CONCLUSÕES: -CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida, -Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão alteração na síntese ou estabilidade da proteína alterações na regulação de transcrição gênica
EQUIPE • COORDENADORA: • Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP • COLABORADORES: • Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA • Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP • Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP • Dr. Alaor Caetano – FAMERP • Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP • PÓS-GRADUANDOS: • Ana Cristina Gobbo César • Lucimari Bizari • Fernanda da Silva Manoel Caetano • Marilanda Ferreira Bellini • Márcia Cristina Duarte • Juliana Garcia de Oliveira • Aline Cristina Targa • Aparecida Perpétuo Fedossi • Héctor Matiolli • INICIAÇÃO CIENTÍFICA: • Isabella Katz Migliori • Yvana Cristina Jorge • Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq