بسم الله الرحمن الرحیم

1. بسم الله الرحمن الرحیم کارگاه میکروب شناسی سیستم ادراری

2. کشت ادراربه منظور تشخيص عفونت مجاري ادراري دربيماران مبتلا به ديزوري، تكرار يا اضطرار در دفع ادرار، همچنين در موارد تب با منشا ناشناخته و يا احتمال عفونت در تجزيه ادرار ضرورت مي يابدعوامل تداخل كننده در کشت ادرار: آلودگي ادرار با مدفوع، ترشحات واژن، دست ها يا لباس ها، استفاده از آنتي بيوتيك ها

3. جمع آوری نمونه ادرار برای انجام کشت میکروبی روش نمونه گيري: متداولترین نمونه ،ادرار وسط تمیز گرفته شده می باشد.جهت احتراز از آلودگی نحوه جمع آوری حائز اهمییت می باشد.در مورد زنان باید آموزش لازم در خصوص تمیز کردن نواحی اطراف منفذ پیشابراه با استفاده از یک قطعه گاز تمیز آغشته با سرم فیزیولوزی استریل داده شود از هیچ گونه محلول ضدعفونی کننده ای نباید استفاده شود زیرا این محلولها می توانند به نمونه ادرار راه یافته و سبب ایجاد کشت منفی گردند .( ابتدا منفذ ادرار بايد به طور دقيق با محلول يددار جهت كاهش آلودگي نمونه شستشو داده شود. ظرف ادرار استريل را به نحو صحيح در محل مناسب قرار داده، مقداري ادرار را دور ريخته و 10- 5 سي سي ادرار از ادرار وسط را تهيه نمايند، درپوش ظرف را ببندند.)نباید اجازه داد نمونه ادرار در بخش یا توالت به مدت طولانی باقی بماند .این موضوع باعث تکثیر ارگانیسم های موجود در ادرار گردد زیرا ادرار یک محط مناسب برای رشد آنهاست.هیچ نمونه ای غیر از نمونه آسپیره شده ناحیح فوق عانه از مثانه برای بررسی عفونت ادراری با عوامل بی هوازی مناسب نخواهد بود.

4. - در صورتي كه نمونه در منزل تهيه مي شود حداكثر طي 20 دقيقه پس از جمع آوري ادرار بايد آنرا در يخچال قرار داده، نمونه ادرار را مي توان تا24-12 ساعت پس از جمع آوري در يخچال نگه داري كرد. در زمان انتقال نمونه به آزمايشگاه آن را در كنار يخ قرار دهند. - در مورد بيماراني كه قادر به دفع ادرار نمي باشند مي توان از سند ادراري استفاده كرد. نمونه هاي اطفال و كودكان كم سن را در كيسه هاي يكبار مصرف به نام كيسهU چمع آوري مي كنند.اين كيسه ها داراي چسبي در اطراف پشت منفذ مي باشد كه به پوست پوبيك كودك مي چسبد. منفذ پيشابراه را پيش از چسباندن كيسه ها بايد تميز نمايند. حتي المقدور صبح اول وقت كيسه را به شيرخوار وصل كرده و تا ظهر ادرار جمع شده ارسال گردد.

5. معیار های نپذیرفتن نمونه ها ی ادرار 1-نمونه آسپیره شده برای بیهوازی نباید به داخل لوله ویا ظرف تخلیه شود زیرا تمام عوامل بی هوازی در مواجهه با اکسژن هوا کشته می شوند2- نمونه هایی که در ظرف اشتباه فرستاده شده ویا برچسب اشتباه دارند3-نمونه هایی که در ظروف نشت دار ویا ظروف مقوایی گرفته می شوند.

6. · نمونه ادرار 24 ساعته: طيف گسترده اي از بيماري ها بويژه بيماري هاي آندوكرين توسط نمونه ادرار 24 ساعته قابل تشخيص اند. روش جمع آوري نمونه: اولين ادرار را انجام داده و آنرا دور بريزند و زمان دقيق را يادداشت كنند (مثلا ساعت 7 صبح)، به مدت يك شبانه روز (24 ساعت)، يعني تا ساعت 7 صبح فردا تمامي نوبت هاي دفع ادرار بايد در ظرف مخصوص جمع آوري شده، در جاي خنك ترجيحا يخچال نگه داري و پس از اتمام كار به آزمايشگاه ارسال كنند

7. نحوه انجام کشت ادرار نمونه ادرار نباید سانتریفوژ شود و قبل از برداشت با لوپ باید کاملاٌ یکنواخت گردد از لوپ کالیبره شده استفاده شود ، لوپ را بصورت عمودی در ظرف ادرار فرو برده وبصورت یک خط در وسط محیط کشت نهاده و سپس همانند شکل آن را پخش می نماییم . معمولاٌ از لوپ 0.001 استفاده می شود به جز در سندرم حاد یوترال خانم ها و نمونه سوپر ایوبیک که لوپ 0.01 بکار می رود. توجه :برای هر یک از محیط ها یکبار لوپ را داخل ادرار نموده وپس از انجام کشت روی شعله استریل نموده وبرای محیط دیگر مجدداٌ عمل کشت را از ابتدا انجام دهید.

9. عوامل بیماریزای احتمالی در ادرار الف-باکتری های گرم منفی : اشریشیاکولی،کلبسیلا،آنتروباکترها،پروتئوس،سودوموناسها، سالمونلاپاراتایفی و نایسریا گونوره.ب- باکتریهای گرم مثبت: انتروکوکوس،استاف اپیدرمیدیس،استاف ساپروفیتیکوس، استاف ارئوس و استرپتوکوکهای همولیتیک

10. تعیین تعداد باکتری تعداد کلونی ایجاد شده در محیط بلاد آگار را بعد از 24 ساعت شمارش نموده در ضریب حجم لوپ ضرب می نماییم

11. تهیه گسترش ورنگ آمیزی باکتری اولین اقدام جهت شناسایی باکتری تهیه ی گسترش و رنگ آمیزی می باشد. بدین منظور ابتدا یک قطره سرم فیزیولوژی استریل بر روی لام (مرکز لام ) قرار داده سپس با یک آنس استریل یک قسمت کوچک از کلونی مورد نظر را برداشته در قطره سرم فیزیولوژی حل نموده بصورت شیرابه در سطح لام به اندازه وضخامت مناسب پخش می نماییم.پس از خشک شدن با کمک حرارت ملایم شعله فیکس نموده ولام آماده برای رنگ آمیزی می باشد.

12. ساخت رنگ متیلن بلو 3دهم گرم متیلن بلو رادر30 میلی لیتر اتیل الکل 95درصد بطور کامل حل نمایید پس از24ساعت این محلول راازکاغذ صافی عبور دهیدتاصاف شود

13. رنگ آمیزی متیلن بلو: 1- سطح گسترش رابه مدت 3تا4 دقیقه بارنگ بپوشانید سپس لام راباآب بپوشانید و شستشودهید. 2- پس ازخشک شدن لام (در هوایاباکاغذ خشک کن) آنرا بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می دهیم . دراین رنگ آمیزی باکتری به رنگ آبی مشاهده می شود .

14. ساخت رنگ گرم روش ساخت کریستال ویوله 20 گرم کریستال ویوله رادر100 میلی لیتر اتانول 95 درصد حل کرده بنام محلول A یک گرم اگزالت آمونیوم رادر100 میلی لیتر آب مقطرحل کرده بنام محلول B محلول A رابه نسبت 1 به 10 رقیق کرده وبا 4 برابر محلول B مخلوط کرده صاف می نمایم روش ساخت لوگول یک گرم یدکریستال ودوگرم یدورپتاسیم راساییده ومخلوط می کنیم وسپس 300 میلی لیتر آب مقطر رابه آرامی به آن اضافه می کنیم روش ساخت محلول بی رنگ کننده 250 میلی لیتر اتانول 95 درصد رابا250 میلی لیتر استون ترکیب کرده ودر شیشه های درب دار نگهداری می کنند . سافرانین (رنگ مخالف) 2/5 گرم سافرانین رابا100 میلی لیتر اتانول 95 درصد مخلوط کرده ودرشیشه های درب دار نگهداری می کنند .

15. رنگ آمیزی گرم :THE GRAM STAIN این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبتوگرم منفیتقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شود

16. روش رنگ آمیزی گرم 1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد 2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه با لوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند . مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند . 4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

17. گرم منفی گرم مثبت

20. اشکال مختلف باکتری سه شکل معمول از باکتری ها وجود دارد:1- کوکسی: شكل يك باكتري كوكسي شكل معمولادايره شكل است بعضي اوقات تخم مرغي يا درا ز و تقريبا نيم ميكرومتر قطر دارند 2-باسیل: به شکل میله ای 3-اسپریلیوم: به شکل فنری

21. انواع کوکسی اسكن الكتروميكروكراف استربتوكوكوس بنومونيا

22. استربتوكوكوس تتراد 4 كوكسي

23. تقسيم به صورت تصادفي توليد استافيلوكوك (خوشه انكوري) مي كند اسكن الكتروميكروطراف استافيلوكك اريوس

24. باسیل اسكن الكتروميكروگراف يك باسيلوس

25. استربتو باسيلوس : باسيل رشته اي اسپیریل: به يك تا سه فرم ديده ميشود

26. اسكن الكترون ميكروكراف ويبريو كلرا ويبريو : يك اسبريل ناكامل يا كاما شكل

27. اسبريل سفت ونازك  اسبيروكيت: اسبريل نازك وبيجيده

28. فتوميكروگراف اسبيروكيت اسكن الكتروميكروگراف اسبيروكيت

30. محیط های کشت مورد نیاز برای کشت ادرار :Blood agar بلاد آگار این محیط بطور گسترده ای در باکتری شناسی پزشکی استفاده می شود ، علاوه بر اینکه یک محیط غنی شده است، یک محیط شاخص برای نشان دادن خواص همولیتیک باکتری هایی مثل استرپتوکوک پنومونیه و پیوژنز می باشد.و عموماٌ در پلیت مورد استفاده قرارمی گیرد.این محیط ، با افزودن خون استریل (ترجیحاٌ خون گوسفندی) به نوترینت آگار استریل مذاب که تا 50 درجه خنک شده باشد تهیه می گردد.غلظت خون ممکن است برای اهداف خاصی از 50-5% تغییر کند ولی معمول ترین غلظت برای کارهای روتین 10% می باشد.

31. کنترل کیفی بلاد آگار

32. :Chocolate agar(Heated blood agar)این محیط برای هموفیلوس انفلوانزا و دیگر ارگانیسم های سخت رشد مثل نیسریا و پنوموکوک مناسب است .در هنگام تهیه این محیط در طی حرارت دادن گلبول های قرمز پاره می شوند و مواد مغذی رها می گردند .نوترینت آگار را ذوب نموده در حرارت 75 درجه به آن خون استریل 10% اضافه نموده ، خون و آگار را با تکان دادن ملایم مخلوط کنید تا وقتی که رنگ خون قهوه ای شکلاتی شود سپس در لوله به صورت شیب دار یا در پلیت تقسیم نمایید.

33. Mueller Hinton agar مولر هینتون آگار این محیط در اصل برای جدا سازی گونه نیسریای بیماریزا تهیه شده . امروزه برای دیسک های آنتی بیوتیکی به منظور آنتی بیوگرام با تکنیک کربی – بایر به کار می رود.

34. :EMB-ائوزین متیلن بلوآگاراین محیط کشت ، محیط افتراقی – انتخابی مفیدی در جداسازی وشناسایی باکتری های روده ای گرم منفی است .رنگ های ائوزین و متیلن بلو اجزائ انتخابی هستند ، در حالی که به باکتری های گرم منفی اجازه رشد می دهند، از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری می کنند . قند های لاکتوز وساکاروز به محیط اضافه شده تا ایزوله را بر اساس تخمیر لاکتوز تفکیک کنند . تخمیر با تغییر رنگ و رسوب رنگ های افزوده شده در اثر افت .پی اچ مشخص و ارزیابی می شود . عمدتاٌ پاتوژن ها لاکتوز مثبت می باشند.که کلونی های آبی – سیاه با درخشندگی فلزی متمایل به سبز ایجاد می کنند (اشریشیا کلی). دیگر کلی فرم های لاکتوز مثبت مثل انتروباکتر کلونی صورتی رنگ ایجاد می کنند.کلونی های لاکنوز منفی (غیر تخمیری) شفاف بوده و کهربایی رنگ یا بی رنگ می باشند.

35. EMBکنترل کیفی

36. :MacConkey Agar- محیط مک کانکی این محیط برای جداسازی باکتری های لاکتوز مثبت از لاکتوز منفی می باشد، دارای نمک های صفراوی و مقدار کمی کریستال ویوله جهت جلوگیری از رشد گرم مثبت ها است به همین جهت به آن محیطی انتخابی و افتراقی نیزمی گویند. ساکاروز ندارد معرف محیط نوترال رد می باشد لاکتوز مثبت ها قرمز یا EMB بر خلاف محیطصورتی ولاکتوز منفی ها بیرنگ می باشند . محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت مدفوع می باشد.M.C محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت ادرار می باشد.EMB

37. کنترل کیفی مک کانکی آگار

38. محیط های افتراقی جهت شناسایی باسیل های گرم منفی Triple Sugar Iron Agar(TSI Agar)این محیط حاوی سه قند گلوکز،لاکتوز و ساکاروز می باشد معرف محیط فنل رد بوده وعلاوه بر آن حاوی سولفات فروز بوده که برای بررسی تولید سولفید هیدروژن استفاده می گردد. برای تفکیک باسیل های روده ای گرم منفی بر اساس تخمیر کربوهیدرات (تغییر رنگ در حضور معرف از قرمز به زرد) وتولید سولفید هیدروژن(سیاه شدن درعمق لوله) به کار میرود. غلظت گلوکز یک دهم (0.1) غلظت لاکتوز یا ساکاروز است. اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی)، اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیایی) ، ارگانیسم گلوکز مثبت می باشد. رنگ زرد در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم مورد نظر گلوکز، لاکتوز و ساکاروز مثبت می باشد. رنگ قرمز در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی یک غیر تخمیر کننده است. بعضی از میکرو ارگانیسم ها ممکن است در روی محیط کلیگلر آیرون آگار سولفید هیدروژن تولید کنند ولی در محیط سه قندی به دلیل وجود ساکاروز که در بعضی موارد مکانیسم آنزیمی تولید سولفید هیدروژن را مهار می کند ایجاد این گاز را نمی کنند مثل بعضی از سالمونلا ها و انتروباکتریاسه.

39. TSI کنترل کیفی محیط

40. Urea agarمحیط اوره –این محیط برای جدا سازی با کتری هایی که قادربه استفاده از اوره و تولید آنزیم اوره آز می باشند به کار می رود مانند پروتئوس و به دو صورت تهیه می شوند.Urea agar Base وUrease Test Broth

41. کنترل کیفی محیط اوره

42. MR-VP Broth محیطاین محیط برای تفکیک باکتری ها براساس واکنش های متیل رد و وژسپروسکوئر به کار می رود .در این محیط با افزودن معرف آلفا نفتول به کشت های میکروبی که قادر به تولید محصول استوئین(استیل متیل کربینول) از تخمیر دکستروز(گلوکز) می باشند در حضور اکسیژن و قلیا اکسید می شود تا دی استیل را تولید کند که با کراتین واکنش می دهد ورنگ قرمز تولید می کند . این واکنش را وژسپروسکوئر مثبت گویند .میکروب های متیل رد مثبت ، مقادیر زیادی اسید در طی تخمیر گلوکز تولید می کنند که بر سیستم بافری فسفات غلبه کرده و به محض افزودن معرف متیل رد رنگ قرمز تولید می کند .

43. ساخت معرف آلفانفتول :A1-محلول 5گرم آلفانفتول را در مقدار کمی الکل اتیلیک 95 درجه حل کرده وحجم آنرا بتدریج به 100 میلی لیتر می رسانیم . :B2- محلول 40 گرم هیدروکسید پتاسیم را در 100ملی لیتر آب مقطر حل می کنیم و در یخچال نگه می داریم اضافه کرده لوله را تکان داده و 15 دقیقه B اضافه وسپس 2 قطره از معرف Aبرای تست ابتدا 6 قطره از معرف بی حرکت قرار می دهیم پیدایش رنگ صورتی متمایل به قرمز نتیجه مثبت است .

44. ساخت معرف متیل رد 0.1 گرم متیل رد را در 300 میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه حل نموده وسپس 200 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه می کنیم. محلول را در ظرف قهوه ای نگهداری می کنیم .پس از اضافه کردن چند قطره به محیط مورد نظر در صورت مثبت بودن قرمز رنگ می شود.

45. MR-VPکنترل کیفی

46. Sulfide Indol Motility(SIM)محیطاین محیط برای جداسازی باسیل های روده ای بر اساس تولید سولفید، اندول و حرکت به کار می رود.این مشخصه ها در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاٌ سالمونلا وشیگلا کمک می کند .در این محیط تیوسولفات سدیم و سولفات آمونیم فروز معرف های سولفید هیدروژن ،معرف کواکس یا ارلیخ برای اندول که در اثر استفاده از پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است به وجود می آید استفاده می شود و شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد محیط امکان پذیر است.

47. SIMکنترل کیفی

48. ساخت محلول کواکس یا ارلیخ 2 گرم از پودر پارا دی متیل آمینوبنزآلدئید + 190میلی لیتر اتیل الکل + 40میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ برای آزمایش حدود 2 میلی لیتر از محیط مورد نظر را داخل لوله ای ریخته وچند قطره از معرف کواکس به آن اضافه می کنیم در صورت مثبت بودن حلقه قرمز رنگ بین محیط ومعرف الکلی ایجاد می گردد.چنانچه نتیجه منفی بود محیط را 24 ساعت دیگر برای بررسی نگه می دارند .

49. Simmons Citrate Agarسیمون سیترات برای افتراق باکتری های گرم منفی بر اساس مصرف سیترات به کار می رود .ارگانیسم هایی که قادرند آمونیم دی هیدروژن فسفات و سیترات سدیم را به عنوان تنها منابع نیتروژن وکربن مصرف کنند به طور نسبی بر روی این محیط رشد می منند و واکنش قلیایی تولید می کنند که با تغییر رنگ معرف برم تیمول بلو از سبز(خنثی) به آبی(قلیایی) مشخص می شود.

50. کنترل کیفی سیمون سیترات