Molekuláris genetikai-genomikai módszerek

1. Molekuláris genetikai-genomikai módszerek Falus András

2. POLIMORFIZMUS Egy populáción belüli genetikailag meghatározott különbség

3. Genomvariációk Gyakori szekvencia Variációk Polimorfizmus Deléció Inszerció Kromoszóma Transzlokáció

5. Variációs típusok Nagyméretű: • Kromoszómaszámbeli • Kromoszóma átrendeződések, kromoszómaszegment duplikációk, és deléciók Közepes: • Szekvencia ismétlődések (repeatek) • Transzpozonok • Kis deléciók, szekvenciális és tandem repeatek (mikroszatelliták) Kicsi: • Single Nucleotide Polymorphisms (SNP-k) • Egyetlen bázis érintő inszerciók és deléciók (indelek)

6. SNP

7. Mi az SNP (Single Nucleotide Polymorphism)? Ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed között egyetlen bázis eltérése ugyanabban a DNS pozícióban, gyakoriság >1 % . ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGT   snp snp Az SNP-k replikációs hiba vagy DNS károsodás révén jönnek létre.

8. Az SNP-k típusai • Génben lévő, kódoló SNP-k • Nem-szinoním • Fenntartja vagy megváltoztatja a fehérje szerkezetét/funkcióját • szinoním • Fenntartja vagy megváltoztatja a splicing-ot • Génben lévő, nem-kódoló SNP-k • Szabályozó/Regulációs SNP-k • Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót • Intronban lévő SNP-k • Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót/splicing-ot • Kapcsolt SNP-k (túlnyomó számú) • Rendszerint gének közöttiek (intergenikusak)

9. Az SNP-k megváltoztathatják vagy változatlanul hagyhatják a fehérje szerkezetét DNS SNP C-ről G-re mRNS RNS kodon CUC-ról CUG-re Fehérje leucinról leucinra Leucin Leucin Nincs változás a fehérje szerkezetében

10. SNP térképek • Sok ember genomjának szekvenálása • A bázissorrendek összehasonlítása az SNP-k felderítése céljából • Egy olyan humán genomtérkép elkészítése, ami az összes SNP-t tartalmazza = ez az SNP térkép • Emberi genomban ~10.000.000 SNP (1/300)

11. SNP térképek Az összes szekvenált kromoszóma SNP pozíció Az összes regisztrált SNP

12. SNP Profil/Mintázat • Minden egyes ember genomja egy sajátos SNP mintázatot hordoz. • Az emberek SNP profiljuk/mintázatuk alapján csoportosíthatók. • Az SNP profilok fontosak a gyógyszeres terápiában a válaszkészség meghatározásában. • Kapcsolat lehet bizonyos SNP profilok és egy bizonyos kezelésre adott meghatározott válaszreakciók között.

13. Rezisztens populáció Betegség iránt fogékony populáció Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re ATGATTATAG ATGTTTATAG génX Az összes rezisztens személynek A van az X gén 4-es pozíciójában, míg minden fogékonynak T van ugyanabban a pozícióban

14. SNP Profilok

15. AZ SNP-k felhasználása • Génazonosítás és –térképezés • Diagnosztika/kockázat becslés • A válaszreakció megbecslése • Homogenitás vizsgálat/kísérlet tervezés • A gén funkciójának azonosítása

16. Az SNP adatok felhasználása • Evolúciós vizsgálatok Különböző polpulációk evolúciós történetének felderítésére • „DNS ujjlenyomat”készítés Apasági vizsgálatok, bűnügyek • Markerként használhatók poligénes jellegek térképezése során • Genotípus specifikus gyógykezelés • A legtöbb gén SNP-ket tartalmaz • A gének 93%-ának egynél több SNP-je van • 39%-uk 10-nél több SNP-t tartalmaz!

17. Kontroll Betegségre nem fogékony Betegségre hajlamos Allél 1 Allél 2 A Marker : Allél 1 = Allél 2 = Az A marker összefüggést mutat a fenotípussal Van-e összefüggés a marker megléte és a betegség között?

19. Következtetés korábbi adatokból és megfigyelésekből SNP: single nucleotide polymorphism ATGCTTCCCTTTTAAA ATTGTTCCCTTTTAAA ATTGTTGCCTTTTAAA ATGGTTGCCTTTTAAA ATAGTTGCCTTTTAAT ATAGTTGCCTTTTAAT ATGATTGCCTTTTAAA ATGATTGGCTTTTAAA ATGTTTCGCTTTTAAA ATGTTTTGCTTTTAAA ATTTTTTGCTTTTAAA ATCTTTTGCTTTTAAA Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10 Patient 11 Patient 12 Good response No response No response Good response No response No response Good response Good response Good response Good response No response No response Good response Good response Good response Good response Good response 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

20. GCCCGCCTC GCCCACCTC Következtetés előre; ki fog jól válaszolni a gyógyszerre? From McLeod and Evans, Ann Rev of Pharmacol and Toxicol, 2001: 41,101-121

21. "Pharmacogenomics will radically change the manner in which we develop drugs." "Soon, we will be able to get the right drug into the right patient." "Applying pharmacogenomics to drug development will cut cycle times to 1.5 - 2 years." "Pharmacogenomics will be able to bring removed drugs back on the market, by predicting who is susceptible to adverse events." A farmakogenomika nagy igérete Közel vagyunk???

22. REPEATS

23. TRINUKLEOTID (TRIPLET) REPEAT BETEGSÉGEK • A trinukeotid repeatek nagyon gyakori szekvenciák • - a legtöbb nem kapcsolódik betegséggel • - sok közülük polimorf (változik a repeatek száma) • Két fő típusuk van • - Nem-kódoló • eltérő mechanizmusúak • - Kódoló • poliglutamin • polialanin

25. Poliglutamin Polialanin betegségek • Neurodegeneratív betegségek • Különböző fehérjék • Funkciónyerés • Változó hosszúság • Expanzió • Replikációs csúszás • CAG vagy CTG repeat • Fejlődési rendellenességek • Transzkripciós faktorok • Funkcióvesztés • +/- Konstans hossz • Állandó • Egyenlőtlen crossing over • GCA, GCT, GCG, GCC • repeatek - nem teljesek

26. (huntingtin) (Huntingtin) a/ feltüntetett repeatszámok a normális tartományra jellemző értékek; b/ zárójelben az érintett fehérjék neve szerepel = kódoló szakaszban = nem kódoló szakaszban

28. HUNTINGTIN MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPP PPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPK KELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIAHELFLLCSDD... 350 kD fehérje 10-11 kb transzkriptum mindenütt expresszálódik ismeretlen funkció összefüggés a repeat-szám és a betegség kezdete között Huntington’s Disease Collaborative Research Group 1993 nyomán

29. PCR

31. Q-PCR

34. MICROARRAY -CHIP

36. Összehasonlító hibridizáció Két különböző biológiai forrás (pl. beteg/egészséges)

37. Microarray Overview Measure Fluorescence in 2 channels red/green Control Hybridize, Wash Analyze the data to identifypatterns ofgene expression Test Prepare Fluorescently Labeled Probes

38. Diffúz nagysejtes B sejt lymphoma Eddig nem volt diff. diagnózisa: • Szövettani • Immunológiai • PCR (egyes gének) • módszerrel

39. A melanoma máj metastasisprediktor génkészlete Előre jelezni melyik melanomás betegnek lesz májáttétje??

40. A mikroarray orvosi gyakorlatban való felhasználásának elvi háttere Az egyes betegek mintáiból készült mikroarray-k Az adatok számítógépes csoportosítása Gének ( 10 - 103) 2 Minták (X-tengely) Prediktor gének kiválasztása Diagnózis, megelőzés, terápia meghatározása A betegségre nézve szelektív mikroarray fejlesztése

42. SINGLE-BASE EXTENSION

43. SNP primer 5’ Tag Primer Extention Labeled terminating NTP 5’ 3’ Denature & Hybridize SNP Primer SNP site 3’ 5’ PCR target Substrate (spot on plate) Tag complement for Hybridization capture

45. http://www.dgci.sote.hu/microarray http://www.dgci.sote.hu/snpcore