Laboratórne metódy a postupy pri vyšetrovaní vzoriek odobratých pri podozrení na nákazu MVP

1. Laboratórne metódy a postupy pri vyšetrovaní vzoriek odobratých pri podozrení na nákazu MVP Vypracovala: Ing. Andrea Brtková, PhD.

2. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • Pôvodca MVP: Paenibacilluslarvae • - grampozitívna fakultatívne anaeróbna sporulujúca baktéria v tvare tyčinky • - tvorí spóry – veľmi rezistentné voči vysokej teplote (deštrukcia v mede po 8,6 min., pri 121°C; vo vosku po 30 min., pri 121°C) • nedisponujú enzýmom kataláza štiepi H2O2 (opak iný Bacillusspp.) • rod Paenibacillus biochemicky aktívny (štiepi široké spektrum anorg. substrátov) • produkcia pyrazínov (charakteristická vôňa na kultivačných médiách) • produkcia enolázy – štiepi proteíny – virulenčný faktor • vysoká genotypová variabilita dokázaná fingerprintingom Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu

3. Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • Klinická prehliadka - hodnotí: • - sila včelstva a jeho prejavy • - intenzita a kvalita plodovania, rovnomernosť zakladania • - celková úroveň a hygiena chovu • Odber vzoriek k laboratórnemu vyšetreniu: • - včelí plást s plodom alebo zásobami • - med • - melivo, vosk • ďalší materiál (peľ, materská kašička, • propolis, dospelé včely)

4. Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • Vzorky je nutné dobre zabaliť (papierový sáčok, papierový obal ...) s presným označením mena a adresy + dôkladne vyplnená žiadanka veter.lekárom resp. povereným asistentom • Laboratórne metódy: • Mikroskopické: natívne preparáty (fázová mikroskopia), farbené preparáty (Gramovo farbenie, Schaefer Fulton acidorezistentné farbenie) • B) Kultivačné metódy:krvný agar, MYPGP agar, MYPPN agar; • inkubácia: aeróbne, pri 34-37ºC po dobu 4-5 dní • C) Detekcia pôvodcu MVP na úrovni molekulárnej biológie

5. Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • Kultivácia pôvodcu MVP z meliva: • extrakcia: 1,5 g meliva + extrakčné činidlo = 1h trepať • pridať extrahovanú zmes k dH2O v pomere 1:3 • 5 minút povariť pri teplote 88-91ºC (aktivácia spór, deaktiváciasprievod.MIO) • pretrepať vyočkovať 5 x 0,2 ml na kultivačné média • kultivácia 4 – 5 dní, pri teplote 37 ºC (chyby) • Kultivácia pôvodcu MVP z plástov: • prizaviečkovanom plode uvoľnímepomocousterilnéhoskalpelaviečkobunky • k zaschnutým larvám a príškvarom - kvapkasterilnejdH2O • obsah 5 – 10 podozrivýchbuniek – naočkovať na 5 PM s Krvnýmagarom • kultivácia 4 – 5 dní, pri teplote 37 ºC (chyby) • Kultivácia pôvodcu MVP z medu a peľu: • zriediť med so sterilnúdH2O v pomere 1:1, v prípadepeľu v pomere 1:10 • 5 minút povariť pri teplote 88-91ºC (aktivácia spór, deaktiváciasprievod.MIO) • pretrepať vyočkovať 5 x 0,2 ml na kultivačné média • - kultivácia 4 – 5 dní, pri teplote 37 ºC (chyby)

6. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • 2010, 2011, 2012: Národný eradikačný program moru včelieho plodu (MVP) • trvanie NP: jeden rok, v prípade nepriaznivej epizootologickej situácie pokračovanie aj v ďalšom roku • vyšetrenie zmesných vzoriek zimného meliva: u všetkých chovateľov matiek; kočujúcich včelstiev • + melivo klinická prehliadka + klinické zmeny vyšetrenie plod. plástu • + plodový plást laboratórne potvrdenie MVP opatrenia na zabránenie šírenia MVP

7. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • Slovensko - melivá: r.2010: celkom: 3922 / (+) 93 = 2% • r.2011: celkom: 4921 / (+) 196 = 4% • ‹50 KTJ/1g meliva; ›50-150; ›150-250; ›250-500; ›500 • r.2011 89 58 21 13 15 • Slovensko - plásty: r.2010: celkom: 379 / (+) 260 = 69% • r.2011: celkom: 715 / (+) 527 = 73% • - nesúlad: (+) melivo – nevyšetrený plást • nevyšetrené melivo – vyšetrený plást

8. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • Západné Slovensko: r.2010: celkom: 731 / (+) 17 = 2,3% • r.2011: celkom: 983 / (+) 49 = 5,0% • pozitivita v roku 2011 stúpla oproti r.2010 (viac vyšetrených vzoriek) • TN – 11% nárast; SC – 6,5% (výnimka TT pokles o 10%) • Plásty: r.2011: celkom: 148 / (+) 125 = 84% • r.2010: celkom : 77 / (+) 58 = 75%

9. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • Južné Slovensko: r.2010: celkom: 1120 / (+) 30 = 2,7% • r.2011: celkom: 1626 / (+) 65 = 4,0% • pozitivita v roku 2011 stúpla oproti r.2010 (viac vyšetrených vzoriek) • RS – 11% nárast; NZ – 9,7% (naopak pokles: DS - 3%; GA – 4,5%) • Plásty: r.2011: celkom: 150 / (+) 127 = 85% • r.2010: celkom : 68 / (+) 18 = 26%

10. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • Severné Slovensko: r.2010: celkom: 956 / (+) 17 = 1,78% • r.2011: celkom: 1440 / (+) 40 = 6,25% • pozitivita v roku 2011 stúpla oproti r.2010 (viac vyšetrených vzoriek) • ZA – 8,5% nárast; DK – 3,5% (naopak pokles: MT 11%) • Plásty: r.2011: celkom: 349 / (+) 213 = 61% • r.2010: celkom : 150 / (+) 108 = 72%

11. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL • Východné Slovensko: r.2010: celkom: 1115 / (+) 29 = 2,60% • r.2011: celkom: 896 / (+) 42 = 4,69% • pozitivita v roku 2011 stúpla oproti r.2010 (viac vyšetrených vzoriek) • RO – 52% nárast; PE – 43% (naopak pokles: MI 20%) • Plásty: r.2011: celkom: 68 / (+) 62 = 91% • r.2010: celkom : 84 / (+) 76 = 90%

12. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Diagnostika pôvodcu moru včelieho plodu v NRL

13. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • Cieľ programu: zistiť zdravotnú situáciu včelstiev u  • registrovaných chovateľoch včiel na celom území SR •  na základe zistených výsledkov vypracovať stratégiu na • zabránenie znižovania počtu včelstiev • v rámci programu sa budú sledovať: AFB, EFB, varoáza, akarióza, AetinaTumida, Tropilaelapsclarae(SK free), nozematóza, vírus chronickej paralýzy včiel, vírus akútnej paralýzy včiel a vírus deformovaných krídel • ozdravením chovov sa zlepší zdravotný stav, znížia sa straty na produkcii medu a ďalších včelích produktov, zabezpečí sa optimálne opelenie poľnohospodár. kultúr a ostatných rastlín • klinické prehliadky, odber meliva a vzoriek, laboratórna diagnostika úradných vzoriek a ostatné náklady potrebné na realizáciu programu = hradené zo štátneho rozpočtu SR Programdohľadu nad zdravotnou situáciou v chovoch včiel v SR

14. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín • štruktúra programu: 3. klinické prehliadky – úradní veterinárni lekári + školení asistenti • I. prehliadka: zhromaždenie údajov - pracovné postupy včelárov, životného prostredí, v ktorom sú včelíny umiestnené, životaschopnosť a zdravotný stav včelstva • II. prehliadka: zistenie abnormálnej úmrtnosti, pri príznakoch ochorenia – odber vzoriek na laboratórne vyšetrenie. Včelár bude upozornený na potrebu samokontroly a povinnosti hlásenia úhynu alebo abnormálneho správania včiel • III. prehliadka: zistenie abnormálnej úmrtnosti, životaschopnosti a zdravotného stavu včelstiev – odber vzoriek na laboratórne vyšetrenie Programdohľadu nad zdravotnou situáciou v chovoch včiel v SR

15. NRL pre choroby včiel – Dolný Kubín Programdohľadu nad zdravotnou situáciou v chovoch včiel v SR

16. Ďakujem za pozornosť