Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED

1. CHU Saint Louis Paris Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED François Simon – Constance Delaugerre Service de Microbiologie CHU saint Louis – Paris 75475 cedex 10 Francois.simon@sls.aphp.fr

2. RETROVIRIDAE • Retroviridae : grande famille • Associés à de nombreuses pathologies incluant : • tumeurs à développement plus ou moins rapide • syndrome neurologique • immunodéficience • Tous les rétrovirus ont : • une structure • une organisation génomique • un mode de réplication similaires

4. Première preuve du passage inter espècesHIV-1 group N & SIVcpz -1998 env gag-pol • virus retrouvé uniquement au Cameroun • particularité = virus recombinant entre VIH-1 groupe M (région Pol) et SIV cpz pour l’enveloppe

5. Un nouveau VIH : passage entre les SIV du gorilles et l’espèce humaine le groupe P

6. HIV-1 4 groupes HIV-2 HIV-1O HIV-1N HIV-1M K A J H A B (I) G B H F C C E D CRF04-cpx* D G (E) F virus mosaïques CRF01-AE* Plus de 40 formes recombinantes ou CRFs Diversité du VIH ? HIV-1 P A B CRF02

7. Groupe M = sous-types « purs » & formes recombinantes circulantes actuelles

8. Distribution géographique des sous-types et des formes recombinantes A, A/B, B, C B B B, B’/C, A/E AG, A, G C A/E, B C, A, D A, A/G, C, D, F1, F2 G, H, J, K, A/E, O, N B, F1, B/F, C B

9. Impacts de la diversité génétique du VIH • Diagnostic : détection du VIH-0 mise en défaut en 1994 • Quantification : sous-quantification/non quantification de sous-types VIH-1 (2) (si CV basse ou indétectable en l’absence de ttt, associée à un taux de CD4 bas), VIH-2 • Sensibilité aux antirétroviraux : • Impact du polymorphisme du gène de la protéase (5) • Prédisposition génétique du sous-type C à la résistance à l’éfavirenz(6), à la névirapine(7) , au ténofovir(8) • Transmissibilité : TME plus importante des sous-types D (9) • Pas d’impact des sous-types sur la réponse au traitement (10, 11) • Vaccination : reste l’enjeu majeur !

11. tat vif rev vpu nef rev gag vpr tat env LTR pol LTR p160 gp160 p55 p68 p31/34 gp41 gp120 p17 p24 enveloppe capside Génome et protéines structurales Gènes Précurseurs macro-protéines Protéines enzymes

12. VIH - cycle de réplication - interaction GP120 et recepteur CD4 - interaction GP41 et membrane cellulaire fusion des membranes Reverse transcriptase polymérase hybride ADN/ARN ADN - ARN viral - intégration au génome (intégrase): ADN proviral - activation transcription ADN proviral

15. Risque de transmission en fonction des stades de l’infection 1/25 1/1000 1/50 à 1/1000 1/1000 1/10 000 Primo-infection Phase asymptomatique SIDA Galvin S, Cohen M Nat Rev Micro 2004

16. Quels sont les examens biologiques qui permettent de faire le diagnostic de l’infection à VIH-1 ? à VIH-2 ?

17. Les moyens du diagnostic • ELISA le plus souvent (en UE) combinés ( de 4eme génération dans l’UE) : détectent Antigène VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2 • Tests dit rapides sont des dispostifs unitaires de réalisation simple sans apport de matériel et ne nécessitant pas de chaine du froid • Western Blot confirment la présence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 • L’ARN plasmatique signe la présence d’un VIH réplicatif à partir des cellules infectées. Les tests dit de « charge virale » quantifie cette réplication en « copie » de virus par mL de plasma • L’ADN proviral ou ADN intégré correspond à la présence du provirus dans les cellules infectées • Les tests de résistance recherchent la présence de mutations du génome VIH sous la pression des antirétroviraux

18. Cinétiques des marqueurs de l’infection Cunningham et al

19. Les moyens du diagnostic • Les EIA combinés ( de 4eme génération dans l’UE) : détectent Antigène VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2 • Les tests dit rapides sont des dispositifs unitaires de réalisation simple sans apport de matériel et ne nécessitant pas de chaine du froid • Les Western Blot confirment la présence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 • L’ARN plasmatique signe la présence d’un VIH réplicatif à partir des cellules infectées. Les tests dit de « charge virale » quantifie cette réplication en « copie » de virus par mL de plasma • L’ADN proviral ou ADN intégré correspond à la présence du provirus dans les cellules infectées • Les tests de résistance recherchent la présence de mutations du génome VIH sous la pression des antirétroviraux

20. Diagnostic indirect : Sérodiagnostic de dépistage • Nature de l’antigène de capture des anticorps • Virus entier purifié • Protéines virales natives ou recombinantes • Peptides de synthèse • Détection des anticorps • Totaux (IgG + IgM) • IgG ou IgM • ELISA combinée : détecte anticorps et antigène • Expression des résultats • Qualitatif (positif ; négatif ; douteux) • Quantitatif (titre) ELISA

21. Test ELISA indirect (Infection par le VIH) Microplaque ELISA : Les puits colorés correspondent à des positivités

22. Exemple d’automates EIA (VIH & hépatites et autres )EIA 4ème génération Ag + Ac Vidas bioMérieux Architect Abbott Axym Abbott Microplaques Behring-Siemens

23. Tests de diagnostic rapide (TDR) : Utilisés depuis plus de 19 ans Test VIKIA VIH ½, bioMérieux Contrôles interne des tests Réaction positive : Présence possible d’anticorps anti VIH-1 T c c Test Determine HIV 1-2 , Inverness C : bande contrôle de bon fonctionnement du test T : bande de réactivité anti VIH

24. la confirmation des infections par le Western Blot western blot VIH-1 avec les poids moléculaires des principaux antigènes (New Lav blot 1, Biorad-Pasteur).

25. Valeurs prédictives • la sensibilité d'un test est sa capacité de donner un résultat positif lorsque l’infection est présente. • la spécificité est la capacité d'un test de donner un résultat négatif lorsque l’infection n'est pas présente. La valeur prédictive positive est la probabilité que le virus soit présent lorsque le test est positif. La valeur prédictive négative est la probabilité que le virus ne soit pas présent lorsque le test est négatif. La valeur prédictive est fonction de la sensibilité et de la spécificité du test ainsi que de la prévalence de la condition à l'étude

26. Sensibilité , spécificité, valeur prédictive • a représente le nombre d'individus malades avec un test positif (les vrais positifs), • b représente le nombre d'individus non-malades avec un test positif (les faux positifs), • c représente le nombre d'individus malades avec un test négatif (les faux négatifs), • d représente le nombre d'individus non-malades avec un test négatif (les vrais négatifs) malade Non malade a b Test + c d Test - VPP = a / (a + b) VPN = d / (c + d) sensibilité = a / (a + c) spécificité = d / (d + b

27. ARN Anticorps anti Enveloppe Ag p24 p34 AC -p24 Années Phases précoces Infection chronique Marqueurs moléculaires et sérologiques lors de l’infection par VIH-1

28. 4 gen EIA Tests rapides D’après Cunningham et al 2009

30. WB HIV-1 WB HIV-2 VIH-2 sous type A VIH-2 sous type A VIH-2 sous type B

31. Principes généraux des TDRImmuno-filtration ou immuno-chromatographie Or Colloidal Conjugé à la Proteine A AC Humains non HIV Ac anti anticorps humain Antigene HIV-1/2 Ac HIV-1/2 ligne contrôle Ligne du test Conjugé avec or colloidal +proteine A. Prélèvement

32. Sang total : sang non décanté avec globules rouges et plasma, en général sang capillaire ou veineux non centrifugé. Ne peut être conservé Le papier filtre serait une alternative Contrôle, biologie moléculaire… Sérum ou plasma : recueil après centrifugation en milieu spécialisé = utilisable pour tous les autres tests, idéal pour conservation, traçabilité « Salive » : recueil standardisé entre gencive et lèvre inférieur : liquide créviculaire Les matrices des TDR ?

33. TDR versus ELISA • Les TDR actuels marqués CE et utilisés sur sérum : • - ne détectent que les anticorps • être considérés comme équivalents en terme de sensibilité en primo infection aux des tests ELISA de troisième génération pour les meilleurs d’entre eux • - difficilement évaluable sur sang total /liquide crévicualaire pour les primo infections • Les test TDR avec détection antigène p24 et anticorps : • Marquage CE en 2009 • Équivalent quatrième génération ? • Difficilement évaluable pour les primo infections

34. Marché mondial anarchique : > 80 tests, nombreux fabricants ,vendeurs et revendeurs (voir du même test !)

35. Des marquages FDA USA et CE UE différents (sauf OraQuick)

36. Avantages et limites des systèmes de dépistage pour le VIH

37. Ré-évaluation des 4 tests CE Sur sang total et du test « salive » et du Determine « 4eme génération » en cours à St Louis (JM Molina- W Rozembaum – F Simon) Vikia bioMérieux Determine Inverness OraQuick sang et salive Insti Biolytical 4 tests marqués CE pour l’utilisation sur sang total, un pour la salive

38. Resultats - patients VIH+ * p 0.02 • 60 tests ont été lus comme négatifs particulièrement avec Oraquick salive • 36 patients, soit 20B, 13 non B , 2HIV-2, 1 HIV0 • taux élevé d’invalides avec le Determine 4th • Aucune détection d’ag p24 Ag y compris lors des primo infection y compris en présence confirmée de p24 sur sérum à 380pg/ml

39. Limites des TDR Difficulté d’évaluation sur sang total et salive des primo infections Sensibilité moindre (primo-infection) que les tests Elisa donc risque de faux-négatifs y compris dans les mois suivants la séroconverion en EIA fréquence des faux positifs Lecture subjective Archivage difficile (photo ? ) Négligence des autres IST, absence de TDR pour HBV marqué CE obligeant à EIA, S coûts

40. Un TDR négatif 3 mois après l’exposition supposée signera l’absence d’infection pour ce risque Ce délai est lié à la moindre sensibilité des TDR en primo infection et à l’incidence des VIH dans notre pays couplée à la diversité génotypiques des souches en circulation Quand rendre un TDR négatifpar rapport à un risque

41. TDR Sang total - TDR Sang total + ou +/- Nouveau prélèvement HIV négatif Sauf exposition VIH dans les 3 mois précédents ou situations d’immunosuppression profonde ou de variants rares Recherche Ac ant VIH-1 et VIH-2 et d’ Ag P24 par un test Elisa 4ème génération (EIA) et par un Western Blot (WB) EIA + WB + HIV positif EIA + & WB + Infection VIH confirmée A différencier entre VIH-1 et VIH-2 EIA – WB + ou - EIA + WB +/- ou - - réaction non spécifique - Erreur d’identification Primo-infection Probable ou VIH-2 Nouveau contrôle sérologique et explorations complémentaires = ARN, suspicion variants

42. Aids, test at home for HIV, € 21,95 a reliable, fast and discret test

44. QUIZ

45. Quantification des CD4

46. Minicytomètres de flux Apogèe A40 Cyflow Counter Easy Guava CD4

47. Quantification ARN VIH-1 Charge virale ARN VIH-1 Plasma EDTA (LCR) Suivi biologique de l’infection à VIH-1