Konstruksi dan ekspresi gen -amilase B. aquimaris MKSC 6.2 rekombinan

1. Konstruksi dan ekspresi gen -amilase B. aquimaris MKSC 6.2 rekombinan

2. Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G AV E K E E R K TGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D P AAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T P GTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T F AAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W V GATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y D CTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D G TATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y L CTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A E GAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D P TATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R W AAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D P GATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P A TTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V A ATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D D CTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G L AACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N R AAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa  Memperoleh protein yang diinginkan dalam jumlah yang cukup

3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PCR Enzim restriksi DNA genom Vektor ekspresi Enzim restriksi ligasi Transformasi cloning host • Isolasi plasmid rekombinan • Analisis • Transformasi expression host ekspresi Protein rekombinan

4. 1 2 4 3 5 • Promoter • Rbs • Start codon (ATG) • Signal sequence  ekspor ke periplasmik • His-tag  pemurnian

5. Merancang Primer • Ujung 5’ primer diberi sisi restriksi • Sisi restriksi harus ada pada mcs vektor tapi tidak ada pada gen. • Sisi restriksi vektor dan gen harus kompatibel. • Hasil rekombinasi harus in frame

6. Gen disisipkan pada multiple cloning site (mcs)

8. Alu I AGCT AGCT AGAAA TCGA TCGATCTTT Dra I TTTAAA TTTAAA TTTCT AAATTT AAATTT AAAGA Alu I AGCT AGCT TCGA TCGA Cla I ATCGAT ATCGAT TAGCTA TAGCTA Compatibility • Pemotongan dengan enzim restriksi yang sama selalu kompatibel • blunt-blunt: selalu kompatibel • blunt-sticky: tidak pernah kompatibel

9. Cla I ATCGAT ATCGAT TAGCTA TAGCTA Hind III AAGCTT AAGCTT TTCGAA TTCGAA Cla I ATCGAT ATCGAT ATCGG TAGCTA TAGCTA TAGCC Hpa II CCGG CCGG CCGAT GGCC GGCCGGCTA sticky-sticky: tidak kompatibel sticky-sticky: kompatibel

10. ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTA MetLysArgArgValLeuSerLeuIleLeuValProPheLeuLeuPheTyrAlaLeuProVal EcoRV GATATCATGAAAAGAAGAGTAC AspIleMetLysArgArgVal CCATGGTGAAAAGAAGAGTAC MetValLysArgArgVal NcoI CCATGGATGAAAAGAAGAGTAC MetAspGluLysLysSer CCATGGTTATGAAAAGAAGAGTAC MetValMetLysArgArgVal

11. Vektor-T • Hasil PCR dengan menggunakan Taq DNA polymerase memiliki ekor-A pada ujung 3’ • Vektor-T: vektor kloning, dilinearkan dengan enzim restriksi menghasilkan blunt-end kemudian ditempeli ekor-T pada ujung 3’

12. A A T T

13. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PCR Enzim restriksi DNA genom DNA vektor Enzim restriksi ligasi Transformasi cloning host • Isolasi plasmid rekombinan • Analisis • Transformasi expression host ekspresi Protein rekombinan

14. Fragmen yg akan disisipkan mudah dideteksi Dapat di sekuensing untuk mengetahui benar/tidaknya sisi restriksi M 1 2 3 4 5 6 • M. Marker • pGEM-Insert/EcoRI/EcoRV • pGEM-Insert/EcoRI • pGEM-Insert/EcoRI/EcoRV • PGEM-Insert/EcoRV • - • pGEM/EcoRI/EcoRV

15. Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G AV E K E E R K TGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D P AAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T P GTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T F AAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W V GATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y D CTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D G TATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y L CTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A E GAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D P TATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R W AAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D P GATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P A TTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V A ATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D D CTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G L AACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N R AAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa

16. Konstruksi vektor ekspresi rekombinan Primer PCR • Forward: gatatcGAAGAACGAAAGTGGCAG • Reverse: gaattcGATTTGCGGTTTTTTCTTCCG 5000 pb 4000 pb 3000 pb 2000 pb 1500 pb Sel inang: E. coli

17. 6900 pb 5400 pb 1500 pb Analisis plasmid rekombinan • Analisis restriksi  ada atau tidak insert • Sekuensing  apakah urutannya benar

19. Sel Inang • Cloning host E. coli: TOP10, JM101, JM109, DH5, DH10β • Expression host E. coli: BL21, origami, rosetta

20. Kontrol Sampel Metoda: Fuwa Substrat: 0,125% pati Inkubasi: 30 menit Suhu: 50 oC pH: 7 (Na-fosfat) Ekspresi gen α-amilase B. aquimaris dalam E. coli BL21 M T0 T4 95 72 55 43 34 26 Induksi: 0,5 mM IPTG selama 4 jam SDS-PAGE: 12%