Porijeklo: citogenetike, genetike i DNA kemije

1. Porijeklo: citogenetike, genetike i DNA kemije

2. Porijeklo: citogenetike, genetike i DNA kemije • 19. Stoljeće – razvoj mikroskopa, fiksativa i boja koje su omogučile bojanje jezgara i kromosoma • 1989. Aleksandar Fleming – prva studija humanih kromosoma dala je vrlo limitrane podatke

3. Porijeklo: citogenetike, genetike i DNA kemije • 1901. Mendelovi proncipi nasljeđivanja • Godinu dana poslije Sutton i Boveri nezavisno su objasnili segregaciju homolognih parova kromosoma i nezavisno razvrstavanje nehomolognih kromosoma u mejozi što može utjecati na ponašanje gena smještenih na kromosomima. • Tada je prvi puta teoretski povezan utjecaj citogenetike na genetiku što je ukazivalo na činjenicu da svaki kromosom mora nositi veći broj gena. • U slijedećih 90 godina dokazano je da su geni posloženi linearno na kromosomu i svaki ima određenu lokaciju.

4. Porijeklo: citogenetike, genetike i DNA kemije • 1924. Feulgen je razvio metodu bojanja nukleinskih kiselina i kromosoma. • 1944. Avery, McLeod i McCarty utvrdili su da su geni građeni od DNA, a ne proteina • 1953.Watson i Crick su kristalografijom pomoću X zraka opisali DNA kao dvostruku uzvojnicu. Nirenberg, Mathai i Ochoa objasnili su genetički kod.

5. Rođenje humane citogenetike • 1923. Painter je objavio da je broj kromosoma u stanici 48. Bila je to greška koja nije popravljena narednih 33 godine. Istraživanje - nekoliko stanica – serijski rezovi testisa – kromosomi nisu bili u jednoj ravnini – neadekvatna metoda. • Razvoj tehnologije rada – stanične kulture • 1936. Blakeslee i Eigsti – kolhicin razgrađuje diobeno vreteno i zaustavlja stanice u metafazi mitoze. • 1952 Hsu – tretiranje stanica hipotoničnom otopinom NaCl pomaže u ispružanju kromosoma.

6. Rođenje humane citogenetike • 1956. Tjio i Levan dokazali su da diploidna stanica ima 46 kromosoma – na na kulturama embrionalnih stanica pluća. • Iste godine Ford i Hamerton potvrdili su to na spermatogonijama i pokazali da stanice u mejozi imaju 23 para kromosomas (bivalenti). • 1960. Moorhead je otkrio da se leukociti periferne krvi mogu potaknuti na diobu fitohemaglutininom. • 1966. Steele i Breg objavili su da amnijska tekučina može poslužiti u određivanju kromosoma fetusa.

7. Rođenje kliničke citogenetike • Nove tehnike citogenetike primjenjivale su se kod osoba sa mentalnom retardacijom ili multiplim malformacijama. • 1959. Lejeune je objasnio Downov sindrom i trisomiju 21. • Iste godine Jacobs i Strong pronašli su muškarca sa Klinefelterovim sindromom, XXY. • Ford je objasnio Turnerov sindrom X0 ili mozaicizam X0/XX, kao i kombiniranu XXY-trisomiju 21.

8. Rođenje kliničke citogenetike • Trisomija 13 i 18 opisane su 1960. – Patau i Edwards. • Među živom novorođenčadi nisu pronađene druge trisomije zato su započete analize u pobačenim plodovima gdje je zaključeno da su ostale trisomije uzrok 3% abortusa. • Strukturne aberacije – 1970. Robertsonova translokacija

9. Rođenje kliničke citogenetike • 1960. Nowel i Hungeford opisali su Philadelphia kromosom kod kronične mijeloične leukemije. • 1963. Penrose je objasnio deleciju 13 kromosoma kao uzrok retinoblastoma.

10. Rođenje kliničke citogenetike • Lejeune je opisao Cri du chat sindrom – deleciju kratkog kraka kromosoma 5 i Wolf-Hirschhorn sindrom kao deleciju kromosoma 4.

11. Lyon-ova hipoteza • 1949. Barr i Bertram opisali su spolni kromatin ili Barovo tjelešce. Barovo tjelešce je neaktivni X kromosom Lyon-ova hipoteza, 1961.

12. Vrijeme pruganja kromosoma • Do 1970. prepoznavanje strukturnih pogrešaka na kromosomu bilo je limitirano. • 1970. Caspersson i sur. otkrili su fluorescentno obilježavanje kromosoma kojim se svaki kromosom može samostalno identificirati. • Standardni sistem kromosomske nomenklature razvijen je kroz nekoliko konferencija, publikacija ili njihovih preporuka. Zadnja nomenklatura iz 2005. je internacionalni sistem humane citogenetičke nomenklature, ISCN.

13. Vrijeme molekularne tehnologije • Molekularna era – metode manipuliranja sa DNA. • MOLEKULARNA HIBRIDIZACIJA postala je od fundamentalnog značaja u molekularnoj biologiji, a IN SITU HIBRIDIZACIJA DNA sa označenim DNA probama najznačajnija tehnika u humanoj citogenetici. Nekoliko tisuća lokusa mapirano je FLUORESCENTNOM IN SITU HIBRIDIZACIJOM, FISH. • Druga značajna tehnika bila je LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE, PCR, koju je razvio Mullis. Ona je omogućila brzo umnožavanje bilo kojeg kratkog fragmenta DNA dajući milijone kopija istog.

14. Vrijeme molekularne tehnologije • Značajan napredak dogodio se kada je razvijena metoda kloniranja DNA fragmenata unutar gena: 1. Plazmid – može primiti fragment do 5kb 2. Bakteriofag- do 15kb 3. Kozmid – do 50kb 4. Gljivični umjetni kromosomi (YAC) – do 1-2Mb 5. Bakterijski umjetni kromosomi (BAC) – do 160-235kb • Ovako klonirani fragmenti mogu se koristiti u proizvodnji fluorescentnih ili radioaktivnih proba. One se mogu koristiti u Southern blotting tehnologiji.

15. Vrijeme molekularne tehnologije – Southern blott

16. Vrijeme molekularne tehnologije • Navedena metodologija omogućila je rasvjetljavanje prije nepoznatih uzroka bolesti i novih mehanizama genske regulacije, nazvan genetski imprinting: gdje se inaktivira ili majčina ili očeva kopija gena. • Molekularne metode su poslužile u identifikaciji gena odgovornih za regulaciju staničnog ciklusa i rasvjetljavanju mehanizama kojima lomovi kromosoma mogu dovesti do nastanka tumora.

17. Plastičnost genoma i kromosomska evolucija • Geni pokazuju značajan stupanj konzervativizma. Analizom regije od 67-kb u Drozofile u kojoj je opisano 12 gena. Skoro svi ti geni imaju srodne gene u ljudskom genomu. Pola ih je zastupljeno u gljivicama, a nekoliko ih je prisutno i u genomu bakterija – ZAPANJUJUČI KONZERVATIVIZAM • Evolucijom eukariota znatno se povečava veličina genoma procesima genske duplikacije, transpozicije, insercije, miješanja egzona i preraspodjele genoma. Na primjer obitelj gena za interferon (IFN) smješten na 9p21-p22 sastoji se od 15 funkcionalnih gena i 11 pseudogena. Amplifikacija gena doprinosi evoluciji.

18. Plastičnost genoma i kromosomska evolucija • Organizacija genoma doprinjela je evoluciji: 1. ponašanje introna – viši organizmi imaju intrione, bakterije ih nemaju 2. ponavljajuće sekvence u genomu – duge LINE i kratke SINE. 3. metilacija DNA – vezanje MCP2 proteina za histonske deacetilaze i prevođenje u neaktivni heterokromatin. U mnogim tumorima postoji hipometilacija. 4. miješanje egzona – produkcija različitih proteina

19. Evolucija autosoma • FISH tehnikom dokazano je samo nekoliko kromosomskih preraspodjela razvojem ljudske rase: dvije translokacije su - fuzija dva akrocentrička kromosoma kojom je nastao ljudski kromosom 2 i t(5,17) u odvajanju gorila. Inverzija čini 90% kromosomskih preraspodjela (FISH-om dokazano 5-6 pericentričkih inverzija na kromosomima 4, 9 i 12. • Neki ljudski kromosomi su izrazito konzervirani: X kromosom i autosomi 6,8,11,12,18 i 19. Kromosomi 1,3 i 7 su najmanje konzervirani i najvulnerabilniji na ionizirajuće zračenje.

20. Evolucija autosoma • Genom mačke 2n=38, ljudski genom 2n=46. Mačiji kariotip se može konstruirati iz humanih kromosoma primjenjujuči 7 kromosomskih lomova i jednu inverziju. FISH je pokazao da je humani kromosom 11 identičan mačjem.

21. Evolucija X i Y kromosoma • Spolni kromosomi sisavaca vjerovatno potiču od para autosoma. Jedan u paru dobio je SRY gen od nekad muške determinirajuće regije (pro-Y) i postao novi Y kromosom, dok je njegov par postao X kromosom. Daljnjom evolucijom uslijedile su još tri promjene: cossing over i rekombinacija između X i Y kromosoma. Mnogi Y-vezani geni su inaktivirani mutacijom. Promjenjena je ekspresija X-vezanih gena – inaktivirana većina gena na jednom X kromosomu kod žena. Udvostručena je ekspresija gena sa aktivnog X kromosoma i kod muškaraca i kod žena da bi se izjednačila sa espresijom autosomnih gena.

22. Evolucija X i Y kromosoma • Inaktivacija X kromosoma kod sisavaca posljedica je prenošenja gena između X kromosoma i autosoma. • Nasuprot visokom konzervativizmu X kromosoma, Y kromosom kod sisavca pokazuje veliku raznolikost i brzu evoluciju između čovjeka i viših primata.

23. Evolucija X i Y kromosoma

24. Evolucija telomeričkih i centromeričkih regija • Humani genom evoluirao je visokom organizacijom genima bogatih i genoma siromašnih pruga. • Genima bogate pruge su blizu telomerama u večini kromosoma izložene visokoj frekvenciji rekombinacija. • Pericentromerička regija je također vrlo plastična. Centomere su rapidno evoluirale. Tu su učestale duplikacije, transpozicije, inverzije i delecije. Večina eukariotskih centrmera sadrži ponavljajuče sekvence ali to varira među vrstama.

25. Budućnost humane citogenetike • Spontani pobačaji, mrtvorođenčad, djeca sa multiplim malformacijama, mentalna retardacija, tumori još se uvijek istražuju koristeći nove tehnike. • Subtelomeričke regije su zasigurno odgovorne za rekombinacije i treba razviti metode otkrivanja nepravilnih rekombinacija. Bolje metode su potrebne i u otkrivanju paracentričkih insercija koje donose 15% rizika za duplikacije i delecije za vrijeme podjele kromosoma.

26. Nerješeni problemi i organizacija genoma • Uloga telomeraznog skraćivanja u bolestima koje nastaju u starijoj životnoj dobi: inzulin neovisan dijabetes, ateroskleroza, hipertenzija. Ako telomerazno skračivanje u tome ima svoj utjecaj kako taj negativan efekt odrediti? • Kakva je uloga telomera, centromera i diobenog vretena u nerazdvajanju kromosoma? • Kako trisomije, duplikacije, delecije utječu na fenotip? • Koji su kritični geni u genetičkom utjecaju? • Da li pozicija gena utječe na evoluciju? Itd, itd...

27. Smjernice • Molekularna citogenetika u zadnjem desetljeću osigurala je razvoj koji se očekuje u budućnosti: kloniranje DNA fragmenata – osigurati će brzo mapiranje novih gena. Razvijati će se nove metode bojanja ili probe koje će biti specifične za kromosomske segmente, pruge ili regije sklone pucanju specifične za nastajanje određenih tumora. • Unošenje humanih gena, DNA segmenata ili umjetnih gena u transgenične životinje omogučiti će in vivo analize utjecaja trisomija, duplikacija, delecija na diferencijaciju, osiguravajući životinjski model.

28. Nove tehnologije • Poboljšanje: mikroskopskih tehnika, kamera, kompjuterskih digitalnih kamera za snimanje ili detekciju fluorescentnih signala. • Izrada novih proba za hibridizaciju omogućiti će razvoj interfazne i preimplantacijske citogenetike. • DNA čip tehnologija – razvoj silikonskih mikročipova za kompjutere • Kreiranje masivnih baza podataka postati će esencijalan dio napretka. • Napredak u metodologiji staničnih kultura – otkrića mitogena za G0 stanice. • Nedavno je kreiran umjetni ljudski kromosom – koristan u korekciji genetičkih oštećenja.