1 / 49

Eksperimenta metodes bioloģijā

Eksperimenta metodes bioloģijā. 4-5 . lekcija. 20 13 ./20 14 . mācību gada 1. semestris. Māris Lazdiņš. Dažādas* - mikas. Geno-mika Transkripto-mika Proteo-mika. Genomika. Iegūto genoma sekvenci analizē ar bioinformātikas metožu (specializētu datorprogrammu) palīdzību. Identificē:

lyre
Download Presentation

Eksperimenta metodes bioloģijā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Eksperimenta metodes bioloģijā 4-5. lekcija 2013./2014. mācību gada 1. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Dažādas* - mikas. • Geno-mika • Transkripto-mika • Proteo-mika LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Genomika Iegūto genoma sekvenci analizē ar bioinformātikas metožu (specializētu datorprogrammu) palīdzību. Identificē: a) potenciālos gēnus - - meklējot pietiekami garus ORF(open reading frame), - identificējot jau aprakstītu (sekvenētu) mRNS (cDNS) atrašanos, novietojumu kopējā genoma sekvencē, LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Genomika Identificē: a) potenciālos gēnus - meklējot iespējamo promoteru sekvenču izvietojumu kopējā genoma sekvencē, - izmantojot DNS sekvenču homoloģiju (līdzību) ar jau aprakstītiem / izpētītiem gēniem un genomiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Genomika Identificē arī citus genoma struktūras elementus: b) ORI(origin of replication)- specifiska sekvence, no kuras sākas DNS replikācija; c) telomēru sekvences; d) centromēru sekvences; e) atkārtoto sekvenču rajonus (piemēram, mikrosatelītu , minisatelītu, insercijas elementu sekvences) u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. ORF ORF (open reading frame). - "vaļējais nolasīšanas rāmis" vai - proteīnu kodējošā gēna daļa. Sākas ar translācijas (proteīnu biosintēzes) iniciācijas vai starta kodonu (parasti triplets - ATG), kam seko pietiekami gara aminoskābes kodējošo tripletu virkne ( prokariotiem - kādi 70 vai vairāk tripletu), kuru secību nepārtrauc neviens no translācijas terminācijas ("STOP") kodoniem (parast tripleti - TGA, TAA vai TAG ). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. ORF Kodonu tabula. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. ORF Nereti ORF meklēšanas rīkiem var mainīt atlases kritērijus - uzstādīt izmantojamo: - translācijas iniciācijas kodonu, - translācijas terminācijas kodon-u vai -us. - minimālo ORF garumu. Vairumā gadījumu proteīnus kodē vismaz kādi 100 kodoni, taču sastopami arī neraksturīgi īsi proteīni. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. ORF Ģenerējot DNS gadījuma sekvences ar nosacījumu, ka visi 4 nukleotīdi (A, C, G, T) genomā pārstāvēti ar vienādu biežumu, kāds no 3 parastajiem "STOP" kodoniem vidēji gadās ik pēc 21 tripleta. Tātad, meklējumos par mazāko ORF garumu uzstādot 21 tripletu vai kādu citu, tikai nedaudz lielāku vērtību, ORF meklēšanas rīki atradīs ļoti daudz gadījuma ORF logu, kuri, visticamāk, nav saistīti ne ar vienu reāla gēna sekvenci. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. ORF ORF meklējumi tiek veikti visos 3 iespējamajos "nolasīšanas rāmjos". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. ORF ORF meklējumi tiek veikti visos 3 iespējamajos "nolasīšanas rāmjos". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. ORF ORF meklējumi tiek veikti visos 3 iespējamajos "nolasīšanas rāmjos". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. ORF ORF meklējumi tiek veikti visos 3 iespējamajos "nolasīšanas rāmjos". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. ORF ORF meklējumi eikariotu genomā ir daudz sarežģītāki. - to gēniem ir mozaīkas struktūra (eksoni mijas ar introniem), - proteīna sākumu kodējošais eksons var izrādīties visai īss, savukārt sekojošā introna sākumā var nejauši atrasties kāds gadījuma "STOP" kodons, - eksonu/intronu/eksonu robežas bieži nesakrī ar tripletu robežām - viena tripleta sākums var atrasties vienā eksonā, bet beigas - nākošajā eksonā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. ORF ORF meklējumi eikariotu genomā ir daudz sarežģītāki. Šeit gēna kodējošās daļas un eksonu/intronu robežas praktiski nosakāmas genomisko sekvenci salīdzinot ar attiecīgā gēna cDNS (mRNS) sekvenci. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. Funkcionālā genomika Funkcionālā genomika iesaista vēl citas metodes, lai gūtu plašāku informāciju par dažādām genoma funkcijām. Pētījumu virzieni: - noskaidrot lokusus (sekvences), kurus saista dažādi regulātorie DNS saistītājproteīni, piemēram, transkripcijas faktori; - noskaidrot aktīvo vai potenciāli aktīvo gēnu lokusus (hiperjūtīgums pret DNāzi I); LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Funkcionālā genomika Pētījumu virzieni: - noskaidrot genoma transkribējamos rajonus (apjomīga RNS, [cDNS] sekvenēšana); - DNS metilēšanas vietu noteikšana u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Funkcionālā genomika Regulatoro DNS saistītājproteīnu saistīšanās sekvenču / lokusu noteikšana. Iecienīta metode - hromatīna imunoprecipitācija (chromatin immunoprecipitation - ChIP vai ChIP-seq). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. Funkcionālā genomika ChIP // ChIP-seq 1. a) DNS izdalīšana un attīrīšana, b) interesējošo DNS saistītājproteīnu ieguve un attīrīšana (no organismu šūnām vai rekombinantām ekspresijas sistēmām); 2. DNS + proteīni => DNS-proteīnu komplekss; 3. Kompleksu nostiprināšana (formaldehīds vai UV); 4. DNS fragmentācija (ultraskaņa, daļēja hidrolīze ar nukleāzēm); LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. Funkcionālā genomika ChIP // ChIP-seq 5. Interesējošo proteīnu imunoprecipitācija ar imobilizētām antivielām; 6. DNS atdalīšana un attīrīšana no proteīniem; 7. Atšķirīgu DNS fragmentu atdalīšana (DNS bibliotēkas veidošana); 8. Iegūto DNS fragmentu (300 - 500 bp) sekvenēšana (ChIP-seq). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Funkcionālā genomika ChIP // ChIP-seq Rezultātā tiek iegūtas tās genoma sekvences, kuras bija saistījis interesējošais (-ie) DNS saistītājproteīns. Tālāk iespējams meklēt to izvietojumu genomiskajā sekvencē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. Funkcionālā genomika Hiperjūtīgums pret DNāzi I (DNase I Hypersensitivity). Tas veidojas transkripcijas faktoriem saistoties pie aktivējamu / aktīvu gēnu promoteriem. - šajās vietās no DNS atdalās histoni; - tur var piekļūt DNāze I un katalizēt DNS hidrolīzi. Nepieciešams saudzīgos apstākļos izdalīts hromatīna pavediens (genomiskā DNS ar nebojātu histonu struktūru). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. Funkcionālā genomika Hiperjūtīgumu pret DNāzi I(DNase I Hypersensitivity). Tiek veikta hromatīna apstrāde ar DNāzi I. DNāzes I jūtīgo vietu noteikšanai tiek izmantotas vairākas atšķirīgas metodes. Visas ir salīdzinoši komplicētas un ietverot DNS hibridizācijas procesu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. Funkcionālā genomika DNS metilēšanas nozīme. DNS metilēšanai pie citozīna 5. oglekļa atoma raksturīga īpašība - samazināt tuvumā izvietotā gēna (-u) aktivitāti. Nobriedušās somatisko audu šūnās šāda metilēšana visraksturīgāka sekvencēm CpG. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. Funkcionālā genomika DNS metilēšanas nozīme. Pieaugušu zīdītāju šūnās vidēji 60% - 90% no visiem CpG motīviem atrodas metilētā stāvoklī. Aktīvu gēnu 5'galā izvietotie CpG sakopojumi, kurus sauc par "CpG saliņām" (CpG islands) parasti nav metilēti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. Funkcionālā genomika CpG saliņas. Ar to parasti saprot vismaz 200 bp garus DNS rajonus, kuros GC īpatsvars ir lielāks nekā 50%. Zīdītāju genomiem raksturīgie "CpG saliņu" izmēri parasti ir 300 - 3000 bp. Cilvēka genomā ir ap 29 000 "CpG saliņu". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. Funkcionālā genomika DNS metilēšanas nozīme. Gēnu 5' galā izvietoto CpG bloku metilgrupas traucē transkribcijai nepieciešamo faktoru saistīšanos pie DNS un tādēļ šādi gēni nav aktīvi. Zināmi arī metil-CpG saistītājproteīni (methyl-CpG-binding domain proteins, MBDs). - tie saistās ar metilētajiem CpG rajoniem, - tur piesaista vēl citus proteīnus. Veidojast labi kondensēts, neaktīvs hromatīns (heterohromatīns), kurā jau plašākos rajonos nekādu gēnu ekspresija nav iespējama. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. Funkcionālā genomika Metilēto citozīna atlikumu noteikšanas metodes ir dažādas: - tiek izmantota nātrija bisulfīta (nātrija hidrogēnsulfīta) (NaHSO3) spēja reaģēt ar nemetilētu citozīnu, kā rezultātā tas tiek pārveidots par uracilu (CpG => UpG). Tālāk šo pārvērtību reģistrēšanai tiek lietota sekvenēšana vai testējamajam CpG specifisks PCR; LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. Funkcionālā genomika Citozīna sulfonāta atlikums Citozīna atlikums skābā sulfonēšana hidrolītiskā dezaminēšana sārmainā desulfonēšana Uracila sulfonāta atlikums Uracila atlikums + HSO-3 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. Funkcionālā genomika Citozīna konversija par uridīnu: Iztekti skābā vidē ar lielu nātrija bisulfīta koncentrāciju veidojas citidīnsulfonāts. Sulfonēšanas reakcija padara nestabilu 4. pozīcijas aminogrupu, kura hidrolītiski viegli atdalās, atstājot uridīnsulfonātu. Sārmainā vidē sulfongrupa atkal atšķeļama, veidojot uracila atlikumu nesošu nukleotīdu. Salīdzinot sekvences pirms unpēc NaHSO3 apstrādes, metilētās vietas raksturo nomaiņa CpG => TpG. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. Funkcionālā genomika Konversijas noteikšana: - sekvenējot: Salīdzinot sekvences pirms un pēc konversijas veikšanas, metilētās vietas raksturo nomaiņa CpG => TpG. - PCR (alēļu vai nukleotīdu specifiskā PCR risinājumā): noderīgs konkrētu CpG metilēšanas statusa noteikšanai. PCR praimeris ietver pirms noteikta CpG izvietotu sekvenci, kas beidzas ar G (nemetilēta statusa noteikšanai) vai A (metilēta statusa noteikšanai). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. Funkcionālā genomika PCR procesā sintezētā DNS netiek metilēta un DNS matrices metilācijas statuss PCR gaitā netiek pārnests. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. Funkcionālā genomika Metilēto citozīna atlikumu noteikšanas metodes ir dažādas: - DNS šķelšana ar restrikcijas enzīmiem, kuri jūtīgi pret DNS metilēšanu, iegūto restrikcijas fragmentu elektroforētiska analīze, bieži ietverot arī DNS hibridizācijas metodes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. Funkcionālā genomika Restrikcijas enzīmi vai restrikcijas endonukleāzes ir enzīmi, kuri atpazīst noteiktas DNS sekvences un šajās vietās (vai tuvu tām) veic abu DNS pavedienu hidrolīzi - DNS molekulas sašķelšanu. Daļa restrikcijas enzīmu, kuru atpazīstamā DNS sekvence ietver CpG motīvu, ir jūtīgi pret šī motīva metilēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. Funkcionālā genomika Biežāk satopami restrikcijas enzīmi, kuri metilētu sekveņču hidrolīzi neveic vai hidrolīze notiek ļoti neefektīvi. Zināmas arī restrikcijas endonukleāzes, kuras katalizē tikai metilētu atpazīstamo sekvenču hidrolīzi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. Funkcionālā genomika Metilēto citozīna atlikumu noteikšanas metodes ir dažādas: - imunoloģiskās metodes, kurās izmanto metil-CpG saistītājproteīnus un tiem specifiskas antivielas u.c. Šādā veidā no kopējā DNS maisījuma tālākai analīzei tiek atdalītas metilētās DNS molekulas (sekvences). [ kā aprakstīts pie ChIP // ChIP-seq]. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. Genomika Mazākais genoms mikroorganismam Mycoplasma genitalium - 582 970 bp - 482 gēni SalīdzinājumamE. coligenoms: - 5 082 025 bp - 4 542 gēni /starp dažādām līnijām šie skaitļi stipri variē/ LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. Genomika >> Sintētiskā bioloģija Mycoplasma genitalium - 582 970 bp - 482 gēni "Minimālās dzīvības projektā" noteikts, ka šo gēnu skaitu var samazināt uz 382. (2005) "Essential genes of a minimal bacterium" http://www.pnas.org/content/103/2/425.abstract LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. Sintētiskā bioloģija Mycoplasma genitalium"saīsinātā" genoma versija tika ķīmiski uzsintezēta 2007. gadā. ~ 270 000 bp. =>Mycoplasma laboratorium Genome Transplantation in Bacteria: Changing One Species to Another http://www.sciencemag.org/content/317/5838/632.abstract Mycoplasma genitalium582 970 bp (pilna garuma) genoms (ar nelielām izmaiņām) uzsintezēts 2008. gadā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. Sintētiskā bioloģija Cerības nākotnē veidot pilnīgi jaunus mikroorganismus ar jauniem, tehnoloģiski noderīgiem īpašību blokiem. - ūdeņraža, biodegvielas ražošanai, - CO2 un citu siltumnīcas efekta gāžu utilizēšanai, - grūti izmantojamu atkritumu/biomasas utilizēšanai, - videi draudzīgas (biodegradējamas) plastmasas (piemēram, PHB - polihidroksibutirātu) ieguvei u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. Sintētiskā bioloģija Gēnu inženierijā parasti organismam pievieno vienu vai dažus gēnus. Sintētiskā bioloģija var veikt daudz nozīmīgākus organisma ģenētiskā materiāla pārveidojumus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. Sintētiskā bioloģija Metožu kopas: a) DNS ķīmiskā sintēze - ~ 1 000 bp fragmenti, b) tos apvieno vektoros ar gēnu inženierijas metodēm, c) vektoru apvienošana ar rekombinācijas palīdzību, d) genoma izmēru DNS ievadīšana šūnās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. Salīdzinošā genomika Salīdzinot genomus: - priekšstats par genomu struktūru un līdzību, - organismu / gēnu radniecību, - organismu / gēnu evolūciju, - hromosomu evolūciju. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. Salīdzinošā genomika Salīdzinot peles un cilvēka genomu: - tikai uz 5% sekvenču iedarbojas selektīvais spiediens. - tikai 1,5% no genoma kodē proteīnus. Ir pseidogēni, klusējošie gēni, gēni ar palielinātu (izmainītu) kopiju skaitu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. Genomika Genomikā, pēc DNS sekvences prognozēto gēnu skaits sanāk ievērojami lielāks, nekā to raksturojot pēc šūnā reāli atrodamo atšķirīgo mRNS un proteīnu skaita. Cilvēkam: pēc genoma DNS sekvences tiek prognozēts 50 000 – 100 000 gēnu; pēc gēnu ekspresijas pēdām tiek lēsts, ka reāli darbojas tikai ap 20 000 – 40 000 gēnu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  46. Genomika Gēni aizņem aptuveni 5% no cilvēka genoma, to kodējošās daļas ~ 2 %. pārējo 95% sekvenču nozīme īsti nav zināma. Pēc DNS sekvences pašreiz nevar viennozīmīgi paredzēt, - kuri no prognozētajiem gēniem būs reāli darbīgi, kādos audos darbosies; - kādas post-transkripcijas modifikācijas notiks ar pre-mRNS (mRNS). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  47. Funkcionālā genomika ENCODE projekts (Encyclopedia of DNA Elements) Nesen (2012) nācis klajā ar atziņām, ka izvērtējot - regulatoro proteīnu DNS saistīšanās vietas, - hiperjūtīgumu pret DNāzi I; - genoma transkribējamos rajonus; - nozīmīgas DNS metilēšanas vietas http://encodeproject.org/ENCODE/ LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  48. Funkcionālā genomika ENCODE projekts (Encyclopedia of DNA Elements) var secināt, ka kādi 80% no cilvēka genoma uzskatami par funkcionāliem. Šo pētījumu ietvaros cilvēka genomā raksturoti ap 4 miljoniem dažādu regulatoro vietu (sekvenču). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  49. Transkriptomika u.c. - - nākamajā sērijā... LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related