Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi a la infección

1. Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi a la infección

2. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al; Science Vol 309; 2005

3. Respuesta inmune innata 1-Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2-Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

4. Rol central de los macrófagos en el control de la infección Fagocitosis como primera línea de defensa contra la infección por T. cruzi

5. 8 min Interacciones Macrófagos - T cruzi 2 O2 + NADPH  2 O2• –+ NADP+ + H+ Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis Villalta et al, 1984 Alvarez, MN et al, 2007

6. Óxido Nítrico Sintasa Actvadores: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, productos derivados de patógenos (virales, bacterianos y de protozoarios) Inhibidores: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β Interacción con células apoptóticas

7. Especies Reactivas del Nitrógeno Especies Reactivas del Oxígeno RNH2 O2 L-Arginina NADPH oxidasa i NOS + 1e- - 5e- Óxido Nítrico O2● _ ● NO - 1e- + 1e- SOD - ONOO peroxinitrito Peróxido de Hidrógeno H2O2 CO2 NO2¯ H+ Nitrito Peroxidasa/H2O2 (MPO) - 1e- + 1e- ONOOH ONOOCO2¯ Radical Hidroxilo Dióxido de Nitrógeno ● NO2 OH¯ OH● + + 1e- - 1e- ●NO2 + CO3●¯ ●NO2+ OH● NO3¯ 2 H2O Nitrato Superóxido (anion radical) ●NO2 + CO3●¯

8. Oxidantes intrafagosomales Macrófago no estimulado 2 hrs de infección

9. Oxidantes intrafagosomales Macrófago estimulado con IFN-ϒ 2 hrs de infección

10. Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas rol del ONOO- en el control parasitario Amastigotas intracelulares 100 80 Infección (%) 60 * 40 20 0 Apocinina O2●- O2●- +●NO

11. Defensas Antioxidantes en T. cruzi

12. TR red Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro (10 3 M-1s-1) (10 3 M-1s-1) TcCPXRed NADPH T(SH)2 TXNox TR ONOOH ox 10 6 M-1s-1 + TcCPXOx TXNred NO2- TS2 NADP TR = tripanotiona reductasa T(SH)2= tripanotiona TXN = triparedoxina TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica Trujillo et al, 2004

13. Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad mediada por ONOO- Células Control Células Control + ONOO- TcCPX + ONOO-

14. Resistencia de cepa TcCPX In vivo In vitro Tc CPX salvaje 120 100 80 Infección (%) * 60 Tripomastigotas en 50 campos 40 20 0 ONOO- O2●- O2●- ONOO- Días post-infección Infección en macrófagos Infección en ratones

15. Evaluación in vivo

16. Caracterización de las cepas TCC CL-WT

17. Contenido de Enzimas Antioxidantes Anticuerpos específicos Contenido relativo de enzima TcCPX TcMPX TcTS TcCPX TcMPX TcTS Epimastigotas de 3 días Tripomastigotas Metacíclicos

18. Enzimas antioxidantes: factores de virulencia Contenido relativo de enzima (tripomastigota metacíclico) Tripomastigotas en 100 campos Tripomastigotas en 100 campos

19. Respuesta inmune innata 1-Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2-Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

20. Activación del complemento sobre la superficie del parásito, Influjo de Ca2+ y disfunción mitocondrial Irigoín, F et al., 2009 Muerte Celular Programada en T. cruzi Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF) CTL SHI SHF SHF Control Ctl SHF Tinción de núcleos apoptóticos Fragmentación ADN Exposición de fosfatidil-serina

21. HE Mito-Hidroetidio (Mitosox) Smith and Murphy, 2003 O2-como mediador de la MCP Detección de O2- mitocondrial en T. cruzi Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)

22. O2- mitocondrial como mediador de la MCP MitoSOX oxidado Tinción nuclear Exposición a suero humano fresco

23. Control TcSODA bp SHF SHI SHI SHF Protección de la MCP por Fe-SOD k = 109 M-1 s-1 2 O2• – + 2H+ O2 + H2O2 Sobreexpresión de la Fe-SODA

24. Infección in vivo Corazón(14 dpi) Infección in vitro Cardiomiocitos Macrófagos peritoneales Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.

25. Activación Clásica Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

26. Activación Clásica Activación Alterna Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

27. Determinantes de la eficiencia de la infección por Trypanosoma cruzi Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con inducción de la iNOS en macrófagos Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo

28. PERSPECTIVAS Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas a un tratamiento coadyuvante Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas dilucidando las señales que llevan a la inducción del proceso de muerte

29. Colaboración Internacional Shane Wilkinson Martin Taylor John Kelly Paola Zago Miguel Basombrio • Departamento de Bioquímica • María Noel Alvarez • Gonzalo Peluffo • Florencia Irigoín • Madia Trujillo • Carlos Robello • Rafael Radi Howard Hughes Medical Institute PEDECIBA (Uruguay) CONICYT (Uruguay) PDT (Uruguay)