BCM 1502 Métabolisme I 25 avril 2013 Biosynthèse et dégradation de l ’ hème Johnny Deladoey MD PhD

1. BCM 1502 Métabolisme I 25 avril 2013 Biosynthèse et dégradation de l’hème Johnny Deladoey MD PhD CHU Sainte-Justine Johnny.deladoey@umontreal.ca

2. Remerciements et Lectures • Remerciements: • Je remercie le Dr Pierre Allard pour la préparation de ce cours. • Lectures: • Ce cours • Biochimie, D. Voet et J.G. Voet, 2ième édition (traduction de la troisième édition américaine), 2005 (De Boeck Université) • Chapître 26-4, pages 1013 et suivante (sauf j et k)

3. Plan de cours Éléments historiques Fonctions du noyau prophyrine et de l’hème Biosynthèse de l’hème 3.1) Régulation de la biosynthèse 3.2) Exemples de porphyries 4) Catabolisme de l’hème 5) Élément contemporain Les figures sont tirées de Voet ², sauf si autrement indiqué.

4. 1. Éléments historiques • L’étude de l’hémoglobine a fait l’objet de nombreuses études. À cet égard, c’est une des première protéine dont : • La masse moléculaire a été déterminée avec précision. • La première à être caractérisée par ultracentrifugation. • La première à être associée à une fonction physiologique. • La première à démontrer qu’une mutation ponctuelle provoque le changement d’un seul acide aminé. • Une des première (la myoglobine en premier) dont la structure tridimensionnelle a été déterminée. • La structure de l’hème et de son noyau porphyrine étant complexe, sa détermination a représenté un défi important. Du point de vue historique : • Prix Nobel de chimie de 1930 à Hans Fisher pour la caractérisation de sa structure. • Ces découvertes ont été aidées par l’analyse des composés accumulés chez les patients présentant des défauts de synthèse de l’hème (porphyries). • Hans Fisher a par la suite caractérisé la chlorophylle et la bilirubine.

5. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème • Le groupement hème est formé d’un noyau porphyrine (protoporphyrine IX). • Par contre, ce noyau porphyrine a de façon étonnante une très grande distribution dans la nature : • Grand nombre d’espèces animales, autant animales que végétales. • Plusieurs protéines aux fonctions différentes.

6. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 1) • Exemples d’utilisation du noyau protoporphyrine (sans ion) • Chlorophylle (complexé au Mg) • Vitamine B12 (cobalamine) (complexé auCo) • Hème (complexé auFe) • Hémoglobine  et myoglobine : Transport et échanges d’O2 • Cytochromes de la chaîne respiratoire : Transporteurs d’électrons • Cytochromes P450 : Détoxification hépatique • Peroxydases et catalases : Enzymes d’oxydoréduction

7. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 2) • La glycolyse aérobique permet la production de beaucoup plus d’énergie utilisable par la cellule que la glycolyse anaérobique. • Cependant, l’O2 à une faible solubilité dans l’eau, soit environ 5mL par litre. • Ainsi chez l’homme : • À 38°C, 1 litre de plasma ne dissous que 2,3mL d’O2. • Avec l’hémoglobine, 1 litre de sang peut transporter 200mL d’O2, soit 87 fois plus que le plasma. • Sans transporteur d’O2, le sang devrait circuler 87 fois plus vite pour livrer la même quantité d’O2 aux tissus.

8. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 3) • Au cours de l’évolution des espèces, plusieurs adaptations et systèmes de transport d’O2 ont été développés. • L'interface anatomique d'échange avec le milieu externe (membranes ou tubes trachéaux chez les invertébrés, branchies puis poumons chez les vertébrés). • L'appareil circulatoire interne dont la complexité va en croissant avec l'évolution. • Les cellules contenant les transporteurs d’O2 dont la flexibilité, le métabolisme et la charge en pigment varient d'une espèce à l'autre. Également, diminution de la viscosité du sang. • Les transporteurs d’O2 eux-mêmes.

9. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 4) • L’hémoglobine fournit 33% du poids des globules rouges. Chez l'homme, le taux normal d'hémoglobine est de 140 à 160 g/L de sang. La quantité d'hémoglobine présente dans la totalité du sang circulant d'un homme de 70 kg est estimée à 750 g. • La séquestration de l’hémoglobine à l’intérieur de cellules spécialisées (les érythrocytes) a été une étape importante dans l’évolution des vertébrés. Ceci a permis : • Un sang moins visqueux. • Des concentrations plus élevées en oxygène. • Une meilleure diffusion de l’oxygène du sang aux tissus. Les érythrocytes sont environ 25% plus grand que les plus petits capillaires, ce qui pourrait aussi avoir un rôle dans le transfert de l’oxygène aux tissus.

10. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 5) • En se limitant aux aspects structuraux, l’hémoglobine a deux composants principaux : • Les globines (partie protéique). • L’hème (composée du noyau protoporphyrine IX et de fer). • La globine • L’hémoglobine a la capacité de former un hétérotétramère composé de 2 chaînes α et de deux chaînes β. Cette structure lui confère des avantages fonctionnels : La coopérativité de liaison de l’O2.

11. 2. Fonctions du noyau porphyrine et de l’hème (suite 6) • Hème (protoporphyrine IX et fer) • L’oxygène n’est pas directement lié à la chaîne polypeptidique, mais plutôt au fer de l’hème. • L’ion Fe2+ (ferreux) peut établir 6 liaisons de coordination • 4 avec des azotes du groupement hème. • 2 avec le groupement azote du noyau imidazole de deux histidines. Ces liaisons sont et peuvent être déplacées par l’O2 pour former l’oxyhémoglobine (HbO2). O = O

12. a 2 3 1 4 I II d b IV III 8 5 7 6 g (hème) 3. Biosynthèse de l’hème • La structure de l’hème est complexe. • Structure cyclique composée de quatre noyaux pyrolles (I à IV). • Les noyaux pyrolles sont reliés par des ponts méthényles (-CH=, a à d) . • Il existe 8 sites de substitutions (1 à 8) qui varient pour former différentes molécules. Dans l’hème, ces substitutions sont: • 4 méthyls (-CH3) → 1, 3, 5, 8 • 2 propionates (-CH2-CH2-COOH) → 6, 7 • 2 vinyls (-CH=CH2) → 2, 4 • Un atome de fer (FeII) au centre .

13. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 1) Les atomes de carbone et d’azote de l’hème proviennent de la glycine et de l’acétate • C’est en 1945 que Shemin et Rittenberg ont identifié les molécules de bases entrant dans la synthèse de l’hème, à l’aide de molécules marquées avec des isotopes. • Ils ont d’abord testé plusieurs composés dans des modèles animaux. La confirmation que l’azote de l’hème provient de la glycine a été démontré suite à l’ingestion de 66g de [15N]glycine par Shemin. • Par la suite, Shemin et autres chercheurs ont démontré à l’aide d’acétate et de glycine marquées avec des isotopes aux diverses positions, que la totalité des atomes d’azote et de carbone de l’hème proviennent de ces deux molécules. • Puis élucidation complète de la voie de biosynthèse de l’hème par d’autres groupes.

14. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 2) Cependant, l’hème n’est synthétisé qu’à partir de glycine et de succinyl-CoA • Le succinyl-CoA comporte 4 atomes de carbones : • 2 proviennent du cycle de l’acide citrique en cours. • Les 2 autres proviennent de cycles antérieurs.

15. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 3) • La biosynthèse de l’hème : • 7 étapes (8 enzymes) • Se déroule en partie dans la mitochondrie (1ère et 3 dernières étapes) et en partie dans le cytosol. 7) Ajout de fer 6) Oxydation 1) condensation 2) condensation 5) oxydation 3) condensation et cyclisation 4) oxydation

16. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 4) Étape 1 • Condensation : succinyl-CoA + Gly → • d-aminolévulénate (ALA) + CO2 • Réaction mitochondriale. • Réaction catalysée par la d-aminolévulénate synthase, dépendante du PLP. • Siège du contrôle de la synthèse de l’hème dans le foie. • ALA quitte la mitochondrie vers le cytosol.

17. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 5) Étape 2 • Condensation : 2 ALA → • porphobilinogène. • Réaction cytosolique. • Réaction catalysée par la porphobilinogène synthase. • Inhibée par les métaux lourds (intoxication au Pb).

18. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 6) Étapes 3 (2 enzymes) • Condensation : 4 PBG → • urophorphyrinogène. • 2 Réactions cytosoliques. • Première réaction : Condensation catalysée par l’uroporphyrinogène synthase. • Cofacteur dipyrrométhane synthétisé par cette enzyme. • Deuxième réaction : Cyclisation catalysée par l’uroporphyrinogène-III co-synthase.

19. 3. Biosynthèse de l’hème (suite 7) Réaction 4 • Cytosolique et catalysée par l’ urophorphyrinogène décarboxylase. (urophorphyrinogène-III → coprophorphyrinogène-III) • Oxydation de 4 groupes acétates en 4 méthyls (1, 3, 5, 8) Réaction 5 • Mitochondriale et catalysée par la corpoporphyrinogène oxydase (coprophorphyrinogène-III → protoporphyrinogène-IX) • Oxydation de 2 groupes propionates en vinyl (2 et 4) • Réaction 6 • Mitochondriale et catalysée par la protoporphyrinogène oxydase (protoporphyrinogène-IX → protoporphyrine-IX) • Oxydation des groupements méthyls reliant les 4 noyaux → liens doubles • Réaction 7 • Mitochondriale et catalysée par la ferrochélatase (protoporphyrinogène-IX → hème) • Incorporation du fer (anémie ferriprive)

20. 3.1. Régulation de la biosynthèse • 2 sites de synthèse de l’hème: • 85% par les cellules erythropoïétiques (hémoglobine) • 15% par le foie (cytovhromes P450) • Régulation spécifique pour chacun des ces sites : • Foie = site d’inhibition principal et la d-aminolévulénate synthase. • Rétroinhibition par un dérivé de l’hème (avec FeIII). • inhibition du transport de l’ALA synthase vers la mitochondrie. • Répression de la synthèse de l’ ALA synthase. • Moëlle osseuse = très différent et mécanisme moins bien compris : • L’entrée de fer dans la cellule serait un facteur limitant. • L’ALA synthase n’est pas le site de régulation principal. • L’hème stimule aussi la synthèse de la globine.

21. 3.2. Exemples de porphyries Porphyrie érythropoïétique congénitale • Déficit en l’uroporphyrinogène-III synthase. • Urine rouge foncée • Photosensibilité marquée (cicatrices) • Coloration brun-rouge fluorescente des dents • Exagération de la pilosité • Cependant, neurologiquement normaux • Origine possible du mythe des vampires / loups-garou? Porphyrie hépatique intermittante aiguë • Déficit en porphobilinogène synthase • Crises abdominales et neuropsychiatriques (insomnie, agitation, hallucinations,…) causées par différents facteurs (médicaments,…) • Le roi George III d’Angleterre (1738-1820) aurait été atteint de cette maladie.

22. 4. Catabolisme de l’hème Comporte 5 étapes • Oxydation de l’hème en biliverdine (verdâtre) • Réduction de la biliverdine en bilirubine (jaune) • Transport de la bilirubine au foie. • Estérification de la bilirubine. 5) Conversion par les bactéries intestinales en urobilinogène, puis en strercobiline (rouge-brun). 6) Absorption d’une partie de l’urobilinogène, converti par le rein en urobiline (jaune). 1 2 3 et 4 5 5 6

23. 4. Catabolisme de l’hème (suite 1) • En fonction de ce que vous venez de voir, expliquez l’origine des couleurs des ecchymoses (bleus). • Suite à une blessure (avec un objet non coupant), il peut y avoir rupture de vaisseaux sanguins et libération de sang dans l’espace tissulaire local, pendant que les capillaires se réparent. La zone touchée est rouge et enflée (A). • Par la suite, les macrophages vont phagocyter les globules rouges ainsi libérés dans l’espace extravasculaire et vont métaboliser l’hémoglobine qu’ils contiennent en biliverdine, puis en bilirubine. • Les couleurs vives d'une ecchymose sont dues aux produits résultant de la dégradation de l‘hémoglobine : la biliverdine (pigment vert) et la bilirubine (pigment jaune) (B). A B

24. 4. Élément contemporain Cancer Letters (2010) Ahead of publication, doi:10.1016/j.canlet.2010.01.033 • Certains agents chimiothérapeutiques, tels le cysplatine, sont des complexes avec des ions métalliques dont l’état d’oxydo-réduction entraîne des dommages cellulaires, dont des dommages au niveau de l’ADN, provoquant la mort des cellules se divisant rapidement. • L’or à l’état d’oxydation +III (Au-III) pourrait être un bon agent anticancéreux, mais il est peu stable. • Les auteurs ont synthétisé des dérivés de prophyrines qui résistent au catabolisme, et qui permettent d’incorporer et de stabiliser un Au-III. • Test de ces composés in vivo, dans un modèle de souris avec cancer et métastases.

25. 4. Élément contemporain (suite 1) Exemple de dérivés porphyrine-Au(III)

26. 4. Élément contemporain (suite 2) • Le dérivé de prophyrine complexé à un ion Au-III, diminue fortement la formation de métastases in vivo (A), et des études in vitro démontrent qu’il inhibe fortement la migration des cellules cancéreuses (B). A B

27. L’examen Tiré de : La vie est courte, volume 2, Thiriet et Larcenet

28. Questions d’examen • Dans quelles protéines retroujve t’on un noyau porphyrine? A) chlorophille b) vitamine B12, c) peroxydases d) hémoglobine (toute ces réponses) • Dans quelles protéines retroujve t’on un noyau hème? A) chlorophille b) vitamine B12, c) autre E d) hémoglobine • Laquelle de ces molécules lie directement l’oxygène a) la globine b) cytochrome P450 c) protoporphyrine d) hème • Montrer dessin de l’hème et demander quelle enzyme est responsable de modifier chimiquement les positions suivantes. Ou y aller à l’inverse en demandant quelle enzyme modifie à la position x. • Quelles sont les molécules entrant dans la synthèse de l’hème. • Laquelle de ces enzymes n’est pas impiquée dans une étapde de condensation de la synthèese de l’hème (mettre 2 pas bonnes) • Quelle réaction est dépendante du PLP a) delata ALA synthase • Montrer deux structures (substrat et produit) de réaction et demander qu’elle enzyme fait cete réaction. • Quel est l’effet de l’oxidation de la coproporryinogène oxydase sur les propriété chimique de cette molécule a) la rendre moins hydrosoluble b) • Laquelle de ces affiramtions concernant la régulation de la biosynthèse de l’hème hépatique (foie) est fausse. • Dans l’ordre suivant, quel dérivé du catabolisme de l’hème est de couleur jaune, verte et brune. A) choix de réponse dans ordre divers) • Un individu dont la maladie empèeche le déversement de la bilirubine estérifiée dans es instestions (cholestase) aura des selles blanches. Pourquoi. • Suite à une contamination importante au plomb, quel(s) enzyme(s) de la voie de la voie de biosynthèse de l’hème sera(seront) inhibée(s) et laquelle sera activée? Expliquez brièvement • Combien de molécules de succinyl-CoA et de glycine sont nécessaires pour synthétiser une molécule d’hème? • Un patient a un défaut enzymatique faisant en sorte que les concentrations des intermédiaires du cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs) sont abaissés. Cela aura t’il un impact sur la synthèse/fonction de l’hème et sur celle des cytochromes P450? • Suite à la synthèse d’uroporphyrinogène III, deux réactions successives d’oxidation mènent à la synthèse de protoporphyrinogène IX. Comment expliquez vous que ces oxydations rendent la protoporphyrinogène IX moins soluble dans l’eau. • Dans une cause de violence conjugale, monsieur X assure qu’il n’a battu sa femme qu’une seule fois. On retrouve chez cette femme de nombreuses blessures, dont plusieurs ecchymoses de couleur rouges, noires/verdâtres et jaunes. Est-ce que monsieur X dit la vérité? Expliquez en une ou deux phrases. • Laquelle de ces enzymes n’a pas de PLP comme cofacteur (mettre seulement de bonnes réponses)