Biotechnologiczne próby udoskonalania fotosyntezy typu C 3

1. Biotechnologiczne próby udoskonalania fotosyntezy typu C3 Journal of Experimental Botany - April 2002: „Overexprssion of C4-cycle enzymes in transgenic C3 plants: a biotechnological approach to improve C3-photosntesis” Tomasz Prajsnar Maciej Łuczyński

2. Plan prezentacji: • Rośliny typu C3 i C4 – wprowadzenie • Rola enzymów cyklu C4 u roślin typu C3 • Fizjologiczna i biochemiczna charakteryzacja roślin C3 z ekspresją genów C4 • Perspektywa na przyszłość – co można jeszcze poprawić w roślinach typu C3

3. Fotooddychanie – poważna wada roślin typu C3: • Rosliny typu C3 (np. pszenica, ryż, soja czy ziemniaki) produkują 3-PGA jako pierwszy trwały produkt asymilacji CO2 - reakcja kat. Rubisco • Rywalizacja O2 i CO2 o centrum aktywne  strata do 50% związanego węgla • Oksygenacja RubP  zmniejszenie asymilacji CO2 i produkcja: 3-PGA i 2-PG. • Szlak fotoodychania jest również związany z metabolizmem aminokw.: Gly, Ser, Glu, Gln – metaboliz. w wysokim stopniu • W mitochondriach uwalniany jest :CO2 i NH3 • Strata CO2 uwidacznia się w punkcie kompensacyjnym : 40 – 60l/l w przestworach międzykomórkowych

4. Wpływ fotoodychania na metabolizm

5. Strategia roślin C4 -zagęszczanie CO2 : • Adaptacja do wyższych temp. i mniej uwodnionych środowisk • Wydajne uwalnianie CO2 w pobliżu Rubisco i znaczny wzrost stosunku karboksylajca/oksygenacja RubP • Znaczne obniżenie strat CO2 - fotooddychanie • Wyrażny wzrost wydajności zużycia H2O i azotu w porównaniu z roślinami typu C3 • Charakterystyczna anatomia typ Kranza komórki mezofilu otaczjące komórki pochwy okołowiązkowej • Mezofil  wiązanie atmosf. CO2 • Pochwa okołowiązkowa  uwalnianie CO2 i związanie go przez cykl C3

6. Wiazanie CO2 przez rośliny C4: • Karbokcylacja PEP przez PEPC  reakcja przebiega w cytoplazmie kom. mezofilu, HCO3- jest używany jako donor węgla  w ten sposób powstaje OAA • OAAjest następnie redukowany do kw. L-jabłkowego, który jest transportowany do kom. pochwy okołow. Gdzie CO2 jest uwalniany w szybkim tempie przez enzym dekarboksylujący • W zależności od typu rośliny C4 :  chloroplastowy NADP-ME  mitochondrialny NAD-ME  cytoplazmatyczny PEPCK • Po dekarboksylacji powstaje pirogronian • Pirogronian jest transportowany do chloroplastów mezofilu  gdzie przy pomocy PPDK odtwarzany jest PEP

7. Wiazania CO2 przez rośliny C4 c.d. : • Wzrost stężenia CO2 w kom. pochwy okoł.  supresja oksygenacyjnej aktywności Rubisco zmnej. fotooddych. • Strategia C4 pozwala na sprawną asymilację CO2 przy niewielkim stopniu otwarcia aparatów szparkowych • Punkt kompensacyjny roślin C4 jest bliski zero lub bardzo niski w porównaniu z roślinami C4  Typ C4  Typ C3

8. Mechanizm zagęszczania CO2 u roślin C4 z NADP-ME

9. Rośliny C4 bez budowy typu Kranz: • Hydrilla verticilla – wodna roślina zdolna do indukcji metabolizmu C4 , ale nie posiadająca anatomii Kranz • Niskie stężenie CO2 powoduje wzrost ekspresji PEPC, ME i PPDK  dochodzi do obniżenia punktu kompen. • Egeria densa– roślina wodna ,która oprócz indukow. fotosynt. C4 wykazuje polaryzację pH powierz. liści • Powierzchnia dolna liścia  pH = 10 • Powierzchnia górna liścia  pH = 4,0 • Mechanizm ten pozwala na wzrost stężenia HCO3- przy dolnej pow. liści

10. Rośliny C4 bez budowy typu Kranz c.d. : • Borszczowia aralocaspica – roślina zdolna do przeprowadzania cyklu C4 w obrębie jednej kom. • Pojedyncze kom. chlorenchymy tej rosliny mają dwa typy chloroplastów z różną zawartością enzymów i zdolnością do produkowania skrobi • Immunolokalizacja enzymów wskazuje że Rubisco jest umiejscowione w chloroplastach bazalnej części kom. chlorench. , natomiast PPDK w chloroplast. W części obwodowej kom.

11. Rola enzymów cyklu C4 w roślinach C3: • Wszystkie enzymy potrzebne do slaku C4 są również obecne u roślin C3 jednak ich aktywność jest bardzo niska • Różna też jest specyficzność tkankowa tych enzymów • Przed przystąpieniem do uruchomienia cyklu C4 w roślinach C3 ważne jest zapoznanie się z fizjol. funkcjami enzymów C4 w roślinach C3

13. Efekty prób wprowadzenia nadekspresji genów cyklu C4 u roślin typu C3 U roślin typu C3: Enzymy cyklu C4 posiadają różne funkcje u roślin typu C3 Zwiększenie aktywności tych enzymów może doprowadzić do zakłócenia metabolizmu lub do efektów kompensacyjnych Zmiany kompensacyjne mogą być podstawą do badań interakcji pomiędzy rożnymi szlakami metabolicznymi

14. Nadekspresja karboksylazy PEP jako pierwszy krok w celu utworzenia cyklu C4 u roślin typu C3 Pierwsza próba: cDNA PEPC z kukurydzy (roślina C4) pod kontrolą własnego promotora do tytoniu (stosowano również promotor wirusa mozaiki kalafiora CaMV) Efekt:około dwukrotne zwiększenie aktywności enzymatycznej PEPC, nie zaobserwowano jednak widocznych efektów w wydajności asymilacji CO2 jak i zmian w wartości punktu kompensacyjnego CO2. Ponadto zauważono negatywne zmiany: ruchy aparatów szparkowych, zaburzenia w metabolizmie wtórnym (biosynteza flawonoidów)

15. Nadekspresja enzymów katalizujących dekarboksylację Nadespresja PEPCK (karboksykinaza PEP) PEPCK jest enzymem cytoplazmatycznym, jednakże wspólna aktywność w cytoplaźmie z PEPC prowadziłaby do cyklu jałowego. Stosuje się fuzję z sekwencją tranzytową z małej podjednostki Rubisco (rbcS). Nadespresja NADP-ME (enzym jabłczanowy) Problem z aktywność w chloroplastach, ponadto zaburzony potencjał redox w stromie chloroplastów

16. Możliwość nadekspresji dwoćh genów (enzymów) Kombinowana nadekspresja PEPC oraz chlor. NADP-ME Efektem jest zmniejszenie wartości punktu kompensacyjnego CO2 z 45 ml/l do 20 ml/l (Flaveria pringlei), jednak tylko przy odpowiednim natężeniu swiatła. Całkiem przyzwoite efekty zaobserwowano u ziemniaka. Nadekspresja PEPC razem z PPDK (dikinaza pirogronianu) Zaobserwowano 35% wzrost wydajności fotosyntezy oraz 22% wzrost plenności w ryżu wykazującym nadekspresję PEPC razem z PPDK. Dalsze analizy w toku.

17. Nadekspresja wielu enzymów cyklu C4 Przy pomocy kolejnych transfekcji plazmidami kodującymi dane enzymy oraz zawierającymi geny oporności na różne antybiotyki (selekcja). Do linii transgenicznych zawierających PEPC, wprowadzano NADP-ME, PPDK oraz PPT. W przypadku tytoniu stosowano krzyżowanie transgenicznych roślin z pojedynczą nadekspresją danego enzymu (różne kombinacje). Analiza otrzymanych roślin w toku.

18. Gatunkowo-specyficzne odpowiedzi metaboliczne na nadekspresję genów cyklu c4 U ziemniaka najbardziej wymowne wyniki - nadekspresja PEPC razem z NADP-ME. Jednakże w przypadku tytoniu nadekspresja samego PEPC przyniosła najlepsze rezultaty. Uświadomiono sobie o trudnościach, związanych z pomyślnym wprowadzeniem sprawnie działającego cyklu C4 do wszystkich roślinach uprawnych.

19. Perspektywy na przyszłość 1. Enzymy otrzymane technikami inżynierii genetycznej (np. PEPC) - zmniejszenie wrażliwości na inhibicję produktem - zwiększenie powinowactwa enzymu do substratu 2. Adaptacje morfologiczne - modyfikacje w anatomii liścia (należy zidentyfikować czynniki odpowiedzialnych za zmiany w anatomii) 3. Promotory - tkankowo-specyficzne - indukowane (np. światłem)

20. Zastosowania Wprowadzenie cyklu C4 do roślin typu C3 spowoduje zmniejszenie przewodnictwa aparatów szparkowych(zmniejszony ubytek wody np. podczas suszy) bez dużego wpływu na asymilację CO2. Cecha ta pozwoli na uprawę tych roślin na terenach niedostępnych dla niezmodyfikowanych roślin typu C3 oraz pozwoli na zmniejszenie zużycia nawozów. Te dwa czynniki wydają się ważniejsze niż tylko wzrost produkcji biomasy.

21. DZIĘKUJEMY za uwagę