Struktura i funkcja białek (I mgr)

1. Struktura i funkcja białek (I mgr) dr Katarzyna Śmietana kasia@protein.pl http://www.protein.pl/protein/downup/struk-funk/ Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer „Biochemia” Carl Branden, John Tooze “Introduction to Protein Structure”

2. Wykład 1 • cztery główne typy funkcjonalne białek • aminokwasy: wzory, właściwości, szczególne cechy kodu genetycznego, • struktury II, III, IV rzędowe białek, mapa Ramachandrana, • preferencje do występowania w określonych strukturach II-rzędowych, • wiązanie peptydowe: cechy charakterystyczne, kąty, • typy oddziaływań, odległość, przykłady, • elementy stabilizujące struktury białek, • efekt hydrofobowy (zwijanie białek, oddziaływanie białko-białko)

3. Wykład 2 • motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta, alfa/beta, alfa + beta • oligomeryzacja białek (typy, przykłady) • rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek, białka szkieletowe, • domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura, specyficzność

4. Wykład 3 • poziomy kontroli funkcji białek • mechanizmy kierowania i regulacji białek • kontrola funkcji białek: degradacja, kowalencyjne modyfikacje, proteoliza, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja, fosforylacja białek, przykłady, wpływ na strukturę/aktywność • molekularne przełączniki • - cykl aktywności białek G, minimalna domena G, zasada działania, białka GAP, GEF, GDI – budowa i mechanizm działania, model działania mięśniowej miozyny i kinezyny • kontrola funkcji białek przez modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja) • degradacja, proteoliza i składanie białek, czterostopniowy mechanizm splicingu białek

5. Wykład 4 • Od sekwencji do funkcji: • -- sekwencje homologiczne, dopasowanie sekwencyjne, motywy strukturalne i funkcjonalne (przykład), zasada 40% • - mikromacierze DNA, żele 2D, Y2H • - modelowanie homologiczne, profile-based threading, metody Rosetta, metoda GRID, THEMATICS • - sekwencje kameleonowe • Biosynteza białka - etapy, funkcje poszczególnych IF, EF i RF, ogólny opis struktury krystalicznej rybosomu, czym jest PTC, synteza wiązania peptydowego, tunel wyjściowy, L22 i SecM

6. Wykład 5 • kinazy białkowe, struktura przestrzenna, mechanizm aktywacji i działania kinaz Src i układu Cdk2-cyklina A • dwuskładnikowy mechanizm sygnalizacyjny bakterii • przeciwciała, MHC I i II, receptor T: budowa, genetyczne i strukturalne podłoże różnorodności • p53, ogólne informacje, budowa domeny oligomeryzacyjnej i wiążącej DNA, kluczowe reszty, białka natywnie niezwinięte • struktura i funkcja bakteriorodopsyny, poryn, kanału potasowego, • trzy typy białek fibrylarnych, • kolagen, filamenty pośrednie, włókna amyloidowe: budowa i cechy szczególne, • foldy metastabilne – priony, amyloidy i serpiny • białka opiekuńcze • podstawowa jednostka symetrii wirusów sferycznych, budowa wybranych wirusów

7. Wykład 6 ?

8. Białka • stanowią aż 75% suchej masy tkanek miękkich naszego ciała • z gr. proteios - pierwszorzędny, o największym znaczeniu • białka są polimerami zbudowanymi z zestawu 20 różnych aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -> już dla stuaminokwasowego białka liczba możliwych sekwencji aminokwasowych (20100) przekracza 10130 • znaczne zróżnicowanie właściwości fizykochemicznych poszczególnych reszt aminokwasowych umożliwia tworzenie przez łańcuchy białkowe bardzo różnorodnych struktur trójwymiarowych odznaczających się często dużym stopniem komplikacji – pozwala to na pełnienie przez białka tak wielu różnych funkcji • różnorodność białek jest widoczna już w ich rozmiarach – znane są białka o masach od tysiąca do ponad miliona Da

9. Białka są najbardziej różnorodnymi i wielofunkcyjnymi cząsteczkami występującymi w komórce Wiązanie - różnorodność rozpoznawanych cząsteczek; komplementarność kształtu i oddziaływań polarnych Kataliza - przyspieszanie reakcji do 17 rzędów wielkości, odpowiednie ułożenie grup reaktywnych, stabilizacja stanu przejściowego, kataliza kwasowo-zasadowa

10. Molekularny przełącznik - zmiana konformacyjna pod wpływem pH lub wiązania liganda przełącza funkcję Białka strukturalne - specyficzna asocjacja podjednostek i białek pozwala na spontaniczne powstawanie nawet bardzo złożonych struktur

11. Wyróżniamy cztery poziomy organizacji struktury białek

12. Od właściwości łańcuchów bocznych zależy wkład różnych reszt aminokwasowych w zwijanie i funkcje białek w pH 7 końcowe grupy łańcucha polipeptydowego (aminowa i karboksylowa) są zjonizowane • zaangażowane tylko w oddziaływania van der Waalsa • unikanie wody i pakowanie się na siebie są podstawą efektu hydrofobowego • Ala i Leu faworyzują powstawanie helisy w przeciwieństwie do proliny • aromatyczny pierścień Phe czasami uczestniczy w słabych polarnych oddziaływaniach

13. mogą tworzyć wiązania wodorowe między sobą, z łańcuchem głównym i innymi cząsteczkami polarnymi (m.in. z wodą) • niektóre dysponują ładunkiem (w zależności od pH i otoczenia)

14. - aa hydrofilowe tworzą wiązania wodorowe ze sobą, z łańcuchem głównym, z polarnymi związkami organicznymi i z wodą • Glu i Asp pKa 5 (ujemnie naładowane w pH 7), ale w otoczeniu hydrofobowym pKamoże wzrosnąć powyżej 7 i wtedy służą jako donory protonu • Lys pKa 10 (w pH 7 dodatnio naładowana), ale w otoczeniu hydrofobowym może spaść poniżej 6 i wtedy Lys staje się akceptorem protonu

15. - His ma dwie grupy –N-H, każda o pKa około 6 • - gdy jedna traci proton, pKa drugiej staje się większa niż 10 • - gdy obie są uprotonowane His jest ujemnie naładowana (bardzo rzadko) • - gdy jedna jest uprotonowana His jest neutralna i zdolna do przyjęcia bądź oddania protonu • Arg jest prawie zawsze uprotonowana • Grupa –SH cysteiny jest najsilniejszym nukleofilem

16. Ser, Thr, Gln i Asn są akceptorami i donorami protonu • -- aa amfipatyczne najczęściej uczestniczą w tworzeniu interfejsów między elementami hydrofobowymi a polarnymi • Tyr zwykle nie jonizuje w pH 7 (pKa=9). Grupa –OH jest donorem i akceptorem wiązania wodorowego, a aromatyczny pierścień Tyr uczestniczy w słabych oddziaływaniach polarnych • Met jest najmniej polarna z grupy aa amfipatycznych, ale jej siarka jest często uczestniczy w oddziaływaniach z jonami metali

17. Sposób organizacji kodu genetycznego odzwierciedla wzajemne podobieństwa aminokwasów • Więcej białek niż genów u Eukariontów: • alternatywny splicing • editing RNA

18. Częstość podstawień aminokwasowych w tym samym białku pochodzącym z różnych organizmów „conservative substitutions”

19. Tworzenie i hydroliza wiązania peptydowego Wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy kwasem karboksylowym i grupą aminową dwóch α-aminokwasówz uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązania amidowe są bardzo stabilne w środowisku wodnym w pH bliskim 7. W komórce tworzenie i hydroliza wiązań peptydowych kontrolowane są enzymatycznie.

20. Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy • Rezonans – delokalizacja elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje: • -częściowy charakter wiązania podwójnego (CNO w jednej płaszczyźnie - dwa kąty torsyjne - ograniczona możliwość rotacji i konformacji; podwyższona stabilność) • polarność wiązania peptydowego, moment dipolowy (możliwe oddziaływania)

21. Oddziaływania stabilizujące białko oddziaływania z wodą lub za jej pośrednictwem C=O i N-H we wnętrzu białka nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, więc tworzą je między sobą prowadząc do powstania struktur II rzędowych i stabilizacji struktury

22. Wykres Ramachandrana Prawie we wszystkich białkach łańcuch główny przyjmuje taką konformację, w której kąty torsyjne phi i psi powtarzają się, tworząc regularne wzory – elementy struktury drugorzędowej Ograniczenia steryczne określają możliwe typy struktury drugorzędowej

23. Zgięcie beta (beta/hairpin/reverse turn) najprostszy element struktury II-rzędowej -NH n+3 (n+2) -O Część grup C=O i N-H nie tworzy wiązań wodorowych w obrębie łańcucha, dlatego zgięcia występują najczęściej na powierzchni cząsteczki białka Obecność zgięć beta pozwala ograniczyć rozmiary białka i nadać mu bardziej zwartą strukturę

24. Helisa alfa – najpopularniejsza struktura II-rzędowa wiązania wodorowe pomiędzy C=O i N-H znajdującymi się blisko siebie w sekwencji n+4 3.6 reszty na skręt

25. Parametry elementów helikalnych n+4n+3n+5

26. Amfipatyczność helis alfa -łańcuchy boczne „wystają” co 100o -reszty oddalone od siebie o 3-4 aminokwasy grupują się po tej samej stronie helisy -helisy amfipatyczne stabilizują pakowanie helisa-helisa i często występują na powierzchni białka

27. Helisy zawierające reszty proliny Struktura kolagenu helisa lewoskrętna (Gly-X-Y)n gdzieX, Y to Pro, Pro-OH lub (rzadziej) Lys Helisy poliprolinowe wszystkie proliny w formie trans tworzą lewoskrętną helisę (3 reszty na skręt); motyw w białkach sygnalnych rozpoznawany przez domeny SH3

28. Struktury beta bardziej stabilna nie są eksponowane do rozpuszczalnika, najczęściej „przeplatane” helisami Silnie rozciągnięty, zwykle lekko skręcony łańcuch polipeptydowy odległość między resztami 3,3 Å Możliwość utworzenia struktury amfipatycznej

29. Kompleks Rap–Raf pakowanie helisy na równoległe włókno beta międzycząsteczkowa struktura beta jako interfejs oddziaływania białko-białko

30. Baryłka beta (b-barrel) -włókna beta, ze względu na konfiguracje L aminokwasów, mają tendencję do prawoskrętu -aminokwasy rozgałęzione na węglu beta (Val, Ile) łatwo akomodują się w strukturze beta (w porównaniu z gęsto upakowaną helisą) białko wiążące retinol z niepolarnym ligandem związanym we wnętrzu baryłki

32. Przewidywanie struktury drugorzędowej - trafność przewidywań zaledwie ok. 70% - najłatwiej określić położenie helis (tworzone dzięki oddziaływaniom reszt sąsiadujących ze sobą w sekwencji) - najtrudniej przewidzieć granice pętli i miejsca zgięć

33. Tworzenie struktury trzeciorzędowej Intermediaty zwijania (barnaza)

34. Efekt hydrofobowy -minimalizacja powierzchni hydrofobowej dostępnej dla rozpuszczalnika -zbliżenie polaryzowalnych grup hydrofobowych umożliwia powstanie między nimi oddziaływań van der Waalsa -tym samym „wciągniecie” polarnych grup C=O i N-H łańcucha głównego staje się siłą sprawczą powstania struktur drugorzędowych

35. Porównanie struktur TIM (izomerazy triozofosforanowej) i DHFR (reduktazy kw. dihydrofoliowego) -podobne elementy struktury drugorzędowej mogą tworzyć białka o całkiem różnych strukturach III° -wynika to ze sposobu łączenia elementów - występowania pętli lub zgięć

36. Pętle -pętle w białkach zwykle ulokowane są na powierzchni, eksponowane do rozpuszczalnika -ponieważ ich wkład w stabilizację struktury białka jest niewielki, w obrębie pętli łatwiej tolerowane są mutacje -dzięki temu pętle łatwo dostosowują się do powierzchni ligandów i często tworzą interfejsy oddziaływań białko-białko

37. Pierwsza powłoka hydratacyjna elastazy -cząsteczki wody ściśle związane z białkiem stanowią część jego struktury

38. Wnętrze zwiniętego białka • - atomy we wnętrzu są upakowane prawie jak w ciele stałym • kanały i szczeliny pozwalają jednak na ruch atomów i zapewniają elastyczność • jeśli w rdzeniu znajdują się większe przestrzenie, to wypełnione są cząsteczkami wody, które mogą oddziaływać z okolicznymi grupami polarnymi

39. Motywy pakowania struktur helikalnych „ridges and grooves” cytochrom b562 ludzki hormon wzrostu

40. Symulowana struktura fragmentu dwuwarstwy lipidowej 20 x 1,5 Å - helisa 8-9 x 3.5 Å - włókno beta -otoczenie hydrofobowe powoduje, że wszystkie polarne grupy (w tym C=O i N-H łańcucha głównego) muszą zostać „zagrzebane” we wnętrzu białka – odwrotnie niż w środowisku wodnym

41. Fragment kompleksu cytochromu bc1 elementy przezbłonowe najczęściej są helikalne, ze względu na możliwość lokalnego utworzenia wiązań wodorowych w obrębie łańcucha głównego

42. Profil hydrofobowości białka DctB z Rhizobium meliloti

43. Błonowe białka beta Struktura transportera FhuA • włókno przezbłonowe = 8-9 reszt • zwykle pod kątem => trudniejsze do przewidzenia • zamknięte baryłki aby zaspokoić HB • często tworzą kanały

44. Struktura bakteryjnego kanału potasowego homotetramer

45. Zorganizowane cząsteczki wody na eksponowanej powierzchni hydrofobowej rybonukleazy A Pojedyncze słabe oddziaływanie uwalnia około 4-13 kJ/mol energii swobodnej Zwinięte natywnie białko jest termodynamicznym kompromisem. Stabilność można zdefiniować jako utratę energii swobodnej, będącą sumą efektów entalpowych i entropowych. Dla większości białek różnica energii między stanem rozwiniętym a zwiniętym jest marginalna, około 21-42 kJ/mol.

46. Stabilność, denaturacja, termofilność • marginalna stabilność dopuszcza duży stopień swobody (niezbędny do wzajemnego dopasowania podczas oddziaływań z ligandami czy katalizy) • stan zdenaturowany rozpoznajemy po utracie aktywności biologicznej/biochemicznej lub zmianie sygnału np. dichroizmu kołowego • denaturację można wymusić wysoką temperaturą oraz chemicznymi denaturantami (chlorowodorek guanidyny, mocznik, SDS), które współzawodniczą z polarnymi grupami białka o wiązania wodorowe • stabilizację białek można uzyskać poprzez skracanie pętli, dodawanie mostków solnych itp.

47. Struktura BPTI stabilizacja przez mostki S-S -zwykle struktura białka jest stabilizowana przede wszystkim przez oddziaływania niekowalencyjne -w niektórych przypadkach istotną rolę mogą też pełnić oddziaływania kowalencyjne, np. tworzenie mostków disulfidowych -dotyczy to głównie białek zewnątrzkomórkowych, ponieważ warunki panujące w komórce są silnie redukujące

48. Fragment struktury subtylizyny stabilizacja przez koordynację metalu (Ca2+) -Kd wiązania metalu w zakresie od mM (bardzo słabe) do nM (bardzo mocne) -w koordynacji mogą uczestniczyć cząsteczki wody -w niektórych przypadkach białka strukturyzują się wyłącznie w obecności jonów metalu, a ich usunięcie prowadzi do denaturacji

49. Stabilizacja przez wiązanie kofaktora dotyczy miejsc aktywnych DaAT/pirydoksal mioglobina/hem+żelazo oksydaza poliaminowa/PQQ cytochrom c/hem+żelazo

50. Modyfikacje potranslacyjne wpływające na stabilność białka SUMOylationS-nitrosylation