Estratégias de sequenciamento : genoma e transcriptoma mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br

1. Estratégias de sequenciamento : genoma e transcriptoma mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br Marcelo Falsarella Carazzolle Laboratório de Genômica e Proteômica Unicamp

2. Resumo • Introdução à genômica • Estratégias de sequenciamento • DNA • ESTs • Tecnologias de sequenciamento • Sanger sequencing • Pirosequenciamento

3. Introdução à genômica Genômica Ciência que estuda o genoma, ou o conjunto do material genético de um organismo. Ex.: Genoma da Xylella fastidiosa é composto pelo DNA cromossomal mais o DNA plasmidial.

4. Como ??? Através de seqüenciamento de DNA : Determinação da sua seqüência nucleotídica (ACGTs). Duas tecnologias de sequenciamento : Sanger sequencing (Megabace, 377, ...) Pirosequenciamento (454)

5. Projetos genoma e transcriptoma Seqüenciamento de material genético, DNA e RNA, de organismo e anotação de estruturas dos genes encontrados Ex.: Seqüenciamento do genoma humano; do cromossomo IV de S. cerevisiae; de ESTs de diferentes espécies de Eucalyptus.

6. Tipos de projeto DNA – seqüenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas. Ex.: Genoma humano ESTs – sequenciamento de cDNA, feitos à partir de bibliotecas de mRNA. Ex.: ESTs de cana-de-açúcar SAGE – sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA

7. Diferenças entre as metodologias • Sequenciamento de DNA, feito de forma aleatória, fornece : • Informações sobre regiões codantes (genes) e promotores. • Mas gera sequências em regiões inter-gênicas (a princípio sem nenhuma função) • Sequenciamento de mRNA fornece : • Informação direta sobre os genes e também sobre a expressão gênica. • Mas genes pouco expressos são mais raros de serem sequenciados por essa técnica • SAGE fornece informação sobre a expressão gênica de forma mais eficiente que ESTs, mas é útil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido • A situação ideal para um projeto genoma é sequenciar ambos DNA e cDNA

8. Estratégias de sequenciamento • - DNA • Shotgun de genoma inteiro • Shotgun em pedaços do genoma clonados em BACs • Primer walking • - ESTs • RNA oriundos de diferentes tecidos ou condições • Biblioteca subtrativa

9. reads clonar em vetor sequenciamento Shotgun do genoma inteiro DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun)

10. Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos (clusterização) reads Sequência consensu (DNA original) A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

11. Shotgun de pedaços do genoma Clonar em BAC’s e sequenciar apenas as pontas de cada fragmento Quebrar em pedaços de 2000pb clonar em vetor e sequenciar os fragmentos Quebrar em pedaços aleatoriamente desde 50Kpb até 300Kpb DNA genômico ~800 bp ~800 bp

12. Primer Sequence New Primer Sequence Repeat Primer Walking Vector Clone to sequence Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição)

13. Expressed sequence tags (ESTs) 5’ EST 3’ EST sequenciamento Extrair RNA de diferentes tecidos/condições Síntese de cDNA clonar em vetor

14. Controle Tratado Extração de RNA e síntese de cDNA Construção da biblioteca e sequenciamento sequenciamento sequenciamento Sequência consensu clusterização tratado Expressão gênica : = 2x controle Artigo : audic e claverie

15. Biblioteca subtrativa RNA Pools Control Treated 1-cDNA synthesis Tester 2-cDNA digestion with 4 cutter enzyme Driver Adaptors 3-Adaptor ligation to tester sample Driver and Tester Driver Tester 4-Tester/ driver hybridization 5-PCR with primers that anneal specifically to adaptor previously ligated to tester sample Linear Amplification Exponential Amplification No amplificated Enriched Tester 6-Enrichment of cDNA library in genes preferentially expressed in tester sample Eliminated Eliminated

16. Tecnologias de sequenciamento • Sanger sequencing • PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467 • Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas) • Pirosequenciamento • Science 281 (1998), n. 5375, 363-365 • Nature 437 (2005), 362-7 • Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)

17. Sanger sequencing anelamento dos primers denaturação

19. Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta “distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read). Filme sequenciamento

20. O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequência : 0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ... Genome Research 8 (3) (1998), 175-185

21. background • A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal • A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background

22. Analisando o cromatograma Região de qualidade alta • Picos bem definidos e grandes. • Linha de base boa. • Distância entre picos anterior e posterior constante.

23. Região de qualidade média – poucas ambigüidades • Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. • Linha de base boa a razoável. • Distância entre picos anterior e posterior razoável.

24. Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade • Picos mal definidos e de tamanho pequeno. • Linha de base confusa. • Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

25. - Sequenciamento produz seqüências da ordem de 500 pb Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base errada : - Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%) - Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)

26. Pirosequenciamento Fita simples Câmera de CCD Reação de degradação Filme sequenciamento Science 281 (1998), n. 5375, 363-365

27. Ligação do adaptador e separação em fita simples Shotgun do genoma inteiro DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun)

28. O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA é ligado em cada grânulo • Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos os reagentes necessários para amplificar o DNA • Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para evitar contaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numa reação de pirosequenciamento • Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz 1011 moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e num período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD Nature 437 (2005), 326-327

29. O sequenciador 454 Câmera de CCD Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas (1,6 milhões/slide) Bombeamento de fluídos Computador Nature 437 (2005), 376-380

30. Pirograma Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt

31. São obtidas seqüências de até 100-120 b

32. Sanger vs Pirosequenciamento • Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho) • Não há clonagem • 1 milhão de pb em 24 horas • 25 milhões de bp em 4 horas (100x mais rápido) • Reads de ~700 bp • Reads de ~100 bp • 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo • 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo • Clones de fita dupla permitem seqüenciamento em ambas direções (facilita orientação e montagem) • Fragmentos fita simples não permitem seqüenciamento em ambas direções Conclusão : a união faz a força PNAS 103 (2006), 11240 SANGER Pirosequenciamento

33. END

34. Path that was used for genome sequencing map (MBP) YACs map (200kBP) BACs or Cosmids m13, plasmid sequence (kbp)