Citometria a flusso

1. Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per l’analisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica. • Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

2. Principio di funzionamento • Un fascio luminoso focalizzatointercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dall’incontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica. • I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici. • Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e all’analisi statistica.

3. Schema di un citometro a flusso capillare fotomoltiplicatore software  raggio Sorgente luminosa particella

4. Sistema fluidico Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quantopuò influenzare il segnale letto dal rilevatore. Poiché il citofluorimetro rilevi una ad unale particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immettanelcapillare ogni singola particella nello stesso punto.

5. Flusso laminare E’ necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento). In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare(idrofocalizzazione del flusso).

6. Flusso laminare/2 In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo l’asse ideale di flusso. flusso interno particella flusso esterno

7. Flusso laminare/3 Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla ladifferenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle all’interno del capillare perotteneresegnali per singole particelle.

8. Tipi di segnale I segnali originati sono solitamente di tre tipi: Diffusione a basso angolo (Forward scatter) Diffusione a 90° (Side scatter) Fluorescenza Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse.

9. fotomoltiplicatore raggio Forward Scatter particella raggi diffratti (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

10. Forward Scatter/2 B A B A Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione del capillare nel il laser colpirà la particella Particelle delle medesime dimensioni che generano due segnali di Forward Scatter differenti

11. SS Side Scatter Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione alla riflessione della luce incidente da parte della superficie della particella. FS

12. Sorgenti luminose La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere. In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’ eccitazione di numerosi fluorofori.

13. Sorgenti al laser La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette l’emissione ad un ridotto numero di lunghezze d’onda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser a  differenti sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon

14. Altre sorgenti Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio. Tale sorgente ha questi svantaggi per l’impiego in citometria a flusso: radiazione poco potente scarsa stabilità nella luce di emissione sistemi elettronici di compensazione rapido decadimento

15. Citometria a flusso di cellule SS FS • Volume (diametro) o dimensioni • Rapporto nucleo/citoplasma • Granulosità interna • Rugosità di membrana Segnali legati alle caratteristiche cellulari: • Fluorescenza • Presenza di marcatori di superficie • Indicatori di attività enzimatica intracellulare • Indicatori di vitalità

16. Cella del citometro a flusso Injector Tip Sheath fluid Fluorescence signals Focused laser beam Coulter Cytometry

17. DIRETTA INDIRETTA singola doppia tripla La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana. Queste tecniche vengono definite “tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta” Tipi di immunofluorescenza per FC

18. Fluorocromo 1 Anticorpo I (a) Antigene “a” Immunofluorescenza singola diretta

19. Fluorocromo 1 Anticorpo II (a) Anticorpo I (a) Antigene “a” Immunofluorescenza singola indiretta

20. Fluorocromo 1 Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Anticorpo I (b) Fluorocromo 2 Immunofluorescenza doppia diretta

21. Fluorocromo 1 Anticorpo II (a) Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Anticorpo I (b) Anticorpo II (b) Fluorocromo 2 Immunofluorescenza doppia indiretta

22. Fluorocromo 1 Anticorpo I (a) Antigene “c” Anticorpo I (c) Antigene “a” Fluorocromo 3 Anticorpo I (b) Antigene “b” Fluorocromo 2 Immunofluorescenza tripla diretta

23. Anticorpo II (a) Fluorocromo 1 Antigene “c” Anticorpo I (a) Anticorpo I (c) Antigene “a” Fluorocromo 3 Anticorpo I (b) Antigene “b” Anticorpo II (b) Fluorocromo 2 Immunofluorescenza tripla indiretta

24. Ottica a tripla fluorescenza Filtri dicroici Filtri a banda passante PMT 4 PMT 3 Cella a flusso PMT 2 PMT 1 Laser Coulter Cytometry

25. Analisi dei dati Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto “citogramma a dot–plot” In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati. I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

26. Citogramma FS/SS: studio morfologico Coulter Cytometry

27. FS/SS di cellule del sangue granulociti linfociti SSC monociti eritrociti FSC

28. Linfociti umani sani CD45+/CD19+ CD45+/CD19- Mean diameter: 8 mm Morphology: dense large nucleus thin cytoplasm • T-lymphocytes 90 - 95% • smooth cells • B-lymphocytes 5-10% villous cells T-lymphocytes B-lymphocytes

29. Linfociti umani neoplastici Mean diameter: 8 mm Morphology: dense large nucleus thin cytoplasm CD45+/CD19+ Mean diameter: 14 mm Morphology: larger B-lymphocytes, lower nucleus density 2 mm 2 mm Raji lymphocytes Burkitt’s lymphoma cell line Healthy B-lymphocytes

30. Raji cells B (19+) CD45 CD45 SS FS B (19+) CD45/FS e CD45/SS di linfociti sani e neoplastici Healthy lymphocytes T (19-) B (19+) Other leukocytes T (19-) + B (19+)

31. 5 % healthy B cells healthy T cells 95% Rappresentazione bidimensionale della doppia fluorescenza di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici Citogramma CD45/CD19

32. Citogramma CD45/FS e CD45/SS neoplastic B cells Neoplastic B cells CD45 Healthy T and B cells Healthy T and B cells SS Rappresentazione bidimensionale di fluorescenza singola e scattering di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici

33. Citometro a flusso come selettore cellulare + FS Sensor 488 nm laser Fluorescence detector - Charged Plates Single cells sorted into test tubes

34. Citofluorimetro analizzatore Coulter Cytometry

35. Citofluorimetro selezionatore cellulare Coulter Cytometry