Un peu d'histoire: 1970: 1 è re greffe de moelle osseuse (GMO) pour 1 d é ficit immunitaire

1. Maladies génétiques Un peu d'histoire: 1970: 1ère greffe de moelle osseuse (GMO) pour 1 déficit immunitaire 1983: GMO non HLA identique (déplétion T) 1990: auto greffe de cellules souches périphériques 1998: sélection de cellules CD34+

2. Traitement par cellule souche patient-spécifique Transfert dans le noyau « Reprogrammation » Nerf Biopsie Transplantation Cellule souche du nerf Nerf Cellule souche du sang Coeur Muscle Sang Isoler et multiplier les cellules souches pluripotentes Développer des blastocytes in vitro

3. Moelle osseuse Sang Lymphocytes T NK B Polynucléaires Cellule souche Monocytes Globules rouges Plaquettes

4. Thérapie géniqueUn défi complexe • Insérer le "bon gène" dans "les bonnes cellules" • Niveau d'expression ni trop faible ni trop fort • Obtenir une expression prolongée si nécessaire (ou régulée…) • Eviter la toxicité • - mutagènèse insertionnelle • - réaction inflammatoire dirigée contre le vecteur ou le produit du transgène

5. Thérapie génique des maladies héréditaires du système hématopoïétique Points clé • Identification du gène responsable • Compréhension de la maladie : pourquoi cette mutation donne “ces signes cliniques” • Durée de vie des cellules transduites • Profil d’expression • Une protéine mutée mais présente peut contrecarrer l’effet bénéfique du gène thérapeutique

6. Déficits immunitaires combinés sévères (DICS) : de bons modèles pour la thérapie génique • Maladies léthales dont le traitement n’est que partiellement satisfaisant • Bases génétiques connues • Le produit génique confère un avantage sélectif aux cellules des précurseurs lymphoïdes transduites • Grande capacité de prolifération des cellules pro-T • Les cellules T matures vivent longtemps ( > années)

7. Signaux gc cytokine-dépendants gc, JAK-3, IL7Ra (53 %) Prévention de l’apoptose cellulaireRéplication de l’ADN ADA (11 %) Signalisation Pre TCR/TCR CD45, CD3, (2 %) Recombinaison V(D)J Rag-1/-2, Artemis (30 %) SCID diseases NK CD8 CLP HSC CD4 THYMUS Compartiment myéloïde B

8. Survie sans événement (%) Génotype identique n=89 Apparentés, phénotype identique n=43 Donneur non apparenté n=24 Quelle différence ? Mois Temps après greffe de CSH Compatibilité donneur-receveur : probabilité cumulative de survie chez les patients atteints de DICS après greffe de CSH Apparenté, HLA partiellement incompatible n=269 . Rejet (cellules NK de l’hôte). Réaction du greffon contre l’hôte. Cellules T ! Registre Européen

9. Résultats à long terme • Faible fonction des cellules T dans certains cas • Déclin à long des terme des fonctions des cellules T • Faible nombre de cellules NK • Immunité des cellules B peu fréquente

10. Principe de la thérapie génique dans le DICS lié à l’X Testé in vitro et in vivo(sourisc KO)

11. . . . . . . . . . . SCID T- B+ SCID T- B+ CONTROL CONTROL PATIENT PATIENT CD3 CD3 CD19 CD19 AR AR X-L X-L AR X-L RIL2 g /CD19 RIL2 g /CD19 DICS T- B+ PATIENT CONTROLE CD3 CD19 RIL2 g /CD19

12. IL-2 IL-4 IL-7 IL-9 IL-15 IL-21 gc gc gc gc IL-9R gc gc IL-2Rb IL-7Ra IL-4Ra IL-2Rb IL-21R IL-2Ra IL-15Ra Développement de lymphocytes NK Développement de lymphocytes T DICS-X1. un défaut du récepteur c IL-15 NK le défaut en gc Absence de lymphocytes T et NK Léthal en l’absence de traitement La greffe de moelle allogénique guérit mais … CLP TCD4 IL-7 HSC TCD8 B

13. What makes the difference ? . Rejection (host NK cells). GVHD. T cells ! Probability of survival of SCID patients according to date of HSCT and to compatibility Geno-id.: 83 %  2000: 73 % URD: 66 % Pheno-id.: 64 % < 2000: 61 % Survival % Survival % Haplo-id.: 50 % Haplo-id. : 50 % Months Months

14. Thérapie Génique du DICS-XI : Etudes précliniques In vitro: Lymphocytes B c(-) - faisabilité - Etude de l’expression et de la fonction Cellules CD34(+) c(-) - Etude de l’expression dans les progéniteurs et à long terme - Différenciation cellulaire NK, T In vivo : Souris c(-) - Toxicité, faisabilité - Avantage sélectif

15. JAK3 JAK3 JAK1 JAK1 P P P P P P P P Voie de signalisation c / JAK / STAT IL-2 g g b b a a STAT5 STAT3 Dimérisation de STAT Noyau Fixation de STATs sur des sites spécifiques de l ’ADN 15

16. P P P JAK3 P P STAT3 P Etudes pré-cliniques Cellules EBV-B des patients DICS-X1 IL-2 c+ 0%    JAK1 Avant transduction STAT5 J180 WBA J30 c+ 50% c+ 100% 0 IL2 0 IL2 0 IL2 Après transduction c- c+ Contrôle

17. Transduction de cellules Sca1+ Rag ou Artemis-/- (Rétrovirus dérivé de MFG) Surnageant rétroviral MFG- gc ou RAG ou Artémis RAG2-/- C57BL/6 Sélection positive de Sca1+ Moelle Osseuse Transplantation (106 cellules) SCF, Flt-3 L, Tpo, Il-6, Il-11, Il-7 (3 Cycles, 5j) RAG2-/- C57Bl/6 3 Gy Irradiation

18. Pourcentage de Survie Semaines

19. Recherche Translationnelle Secteur spécifique de la thérapie cellulaire, chargé de traduire une expérience réalisée à l’échelle de laboratoire dans une expérience à large échelle utilisable pour l’homme

20. Calendrier de la phase translationnelle

21. Manipulation cellulaire de grade cliniqueDescription du processus : depuis le concept jusqu’à la transplantation

22. Sécurité et Réglementation (1) • Laboratoire accrédité pour la production du vecteur • Absence de micro-organismes dans les cellules de production du vector et dans le surnageant • Absence de virus compétent pour la réplication dans les lots cliniques ainsi que dans les échantillons des patients • Le laboratoire doit être accrédité par les autorités compétentes et doit recevoir l’autorisation du Ministère

23. Comité d’Ingéniérie Génétique Comité de Génétique et de Biologie Moléculaire Comité Essais Cliniques Sécurité et Réglementation (2) Autorisation obtenue pour le protocole par : 1) Administration de l’AP-HP 2) Agence française du médicament: AFSSAPS 3) CCPAP

24. Enfant Injection I.V. Moelle osseuse Lavage des cellules Purification decellules précurseurs(CD34) J4 J1 « Activation » J3 J2 Infection par le rétrovirus contenant le gène gc

25. Essai Clinique de TG pour le DICS-XI (1er Janvier, 2012) Moyenne du suivi = 11 ans, 8 patients vivants qui vont bien

26. 9000 P4 * 7000 5000 * P8 P10 * P7 3000 P5 P2 P6. * 1000 P9 0 90 80 0 10 20 30 40 50 60 70 Restoration of immune parameters Full correction of T-cell immunodeficiency Phenotype, function, TCR repertoire diversity P1 100 months after gene therapy Correction of humoral function: normal serum Ig levels(except for 2 patients) Differentiation of functional NK cells but subsequent decrease = HSCT (Limited expansion capacity of NK cell precursors ?)

27. 100 83.1% 80 60 SCID disease-free survival (%) 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 Time (months) Outcome of gene therapy trials in 20 patients with SCIDX1 (Paris-London data combined)

28. Transduction de progéniteurs multipotents (?) T NK CLP B Sites d’intégrationpartagés Progeniteurrs multipotents PMN HSC Monocyte CMP • Nbre de copies de vecteur dans les cellules B < 0.1% 7 à 10 ans après TG • CD15+ négatives pour le transgène

29. Essai clinique TG SCID-X1: caractéristiques des 4 effets indésirables graves (EIG)

30. Un effet indésirable sévère chez 4 patients à Paris et chez 1 patient en Angleterre • Prolifération monoclonale des lymphocytes T provoquée • par l'insertion du rétrovirus dans un oncogène • Facteurs associés : infection virale, réponse immune, • susceptibilité génétique… • Quelle attitude adopter ? suspension de l'essai, analyse du risque confrontée au bénéfice, changement du vecteur • retour à la recherche fondamentale • autour du virus et • autour de la maladie

31. MFG gc MFG gc 1 2 3 4 5 6 P4 P10 P5 Enhancer activity MFG gc LMO-2 mRNA 2. 3 kb 1 2 3 4 5 6 LMO-2 RNA Transcript (Northern blot analysis) LMO-2 Protein expression (Western blot analysis) M. erythroleukemia LMO-1 leukemia M-erythroleukemia H. erythroleukemia LMO-1 leukemia CHO/LMO-2 gd T P4 gd T P4 CHO LMO-2 LMO-2 Structure du gène LMO-2 et intégration du provirus

32. Comment améliorer la Sécurité ? • Sélection des patients ?? • Utilisation d’un LTR self-inactivé (SIN) Vecteur rétroviral LTR-dirigé: MFG gc Q Y U5 R R U5 IL2RG MoLV MoLV SA SD Nouveaux vecteurs retroviraux SIN: Sin11 / SRS11 Q Y R U5 R U5 IL2RG Prom. Δ MP PRE SD EF1(S) RSV

33. Le promoteur EF1 est moins mutagénique P<0.001 détection limite SF EFS SF.HS4 Etude de clonogenicité in vitro (C. Baum’s lab.)

34. Comment améliorer l’efficacité ? • Pas indispensable pour le DICSIndispensable pour les maladies dans lesquelles le transgène ne fournit pas d’avantage sélectif • Vecteurs lentiviraux :  du taux de transduction des cellules souches: important pour les protocoles de TG pour ALD et -thalassémie •  Compétition avec les cellules non transduites cytoréduction (+/- sélection) access to stem cell niches (anti c-kit ab…)