Czynniki inicjujące translację – determinanty oporności roślin na wirusy z rodziny Potyviridae

1. Czynniki inicjujące translację – determinanty oporności roślin na wirusy z rodziny Potyviridae Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek Zakład Biofizyki, IFD UW 1

2. Inicjacja translacji u Eukaryota Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 2

3. Roślinny kompleks inicjujący translację • eIF4E i eIF(iso)4E ~50% podobieństwa w sekwencji aa ~24 kDa • eIF4G - 180 kDa eIF(iso)4G - 86 kDa • eIF4F i eIF(iso)4F Podobna aktywność przeprowadzania translacji in-vitro eIF(iso)4F preferuje hipermetylowane kapy i mRNA mniej ustrukturyzowane eIF4F bardziej wydajny w prowadzeniu translacji niezależnej od kapu (RNA ustrukturyzowane i z wewnętrznymi miejscami inicjacji) oraz w warunkach inhibicji translacji zależnej od kapu Arabidopsis thaliana: Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 3

4. Potywirusy – postrach roślin • Rodzaj Potyvirus jest największy wśród wirusów roślinnych • To ok. 30% wszystkich znanych wirusów roślinnych • Najbardziej powszechne i niszczycielskie • Duże straty w rolnictwie – atakują wiele ważnych roślin uprawnych Nawet 50% straty w zimowej produkcji jęczmienia w Europie i Wschodniej Azji z powodu: Barleyyellow mosaic virus Barley mild mosaic virus Zakład Biofizyki, IFD UW 4

5. Wirusy z rodziny Potyviridae • Genom - jednoniciowe RNA o dodatniej polarności (ok. 10 kb) • Należą trzy rodzaje: Potyvirus i Rymovirus - jeden segment RNA Bymovirus - genom podzielony na dwa segmenty VPg (viral genome-linked protein) kowalencyjnie związane z 5`-końcem RNA • Każdy segment koduje jedną poliproteinę Wycinanie z poliproteiny przynajmniej 8 dojrzałych białek przez wirusowe proteazy Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 5

6. Potywirusowe VPg • ~25 kDa • Prekursor NIa: N – VPg wewnętrzne miejsce cięcia proteaza C VPg wiąże się kowalencyjnie (przez Tyr) do nowo syntetyzowanego RNA • Rola w cyklu życiowym potywirusa: • Oddziaływanie z wirusową polimerazą RNA -> replikacja • Akumulacja w jądrze -> replikacja? • Oddziaływanie z eIF4E lub eIF(iso)4E warunkuje zajście infekcji wirusowej Zakład Biofizyki, IFD UW 6

7. Oddziaływanie VPg-eIF4E ułatwia translację niezależną od kapu Utworzenie ciasnej pętli Inhibicja eIF4E-zależnej translacji w komórce -> uwolnienie rybosomów Ruch z komórki do komórki Replikacja genomu Stabilność wirusowego RNA Postulowane funkcje izoform eIF4E podczas infekcji Dreher et al. (2006) Virology 344, 185 Lellis et al. (2002) Current Biol. 12, 1046 Utworzenie ciasnej pętli podczas inicjacji replikacjiUrydylowane VPg primerem Zakład Biofizyki, IFD UW 7

8. Oporność roślin • Zaburzone oddziaływanie VPg-izoforma eIF4E uniemożliwia rozwój infekcji potywirusowej -> roślina uzyskuje oporność • Oporność recesywna – nieadekwatność lub brak czynnika wymaganego w cyklu życiowym wirusa Geny oporności o charakterze dominującym - odpowiedź nadwrażliwości na infekcję (gen-za-gen) • Wiele naturalnych genów oporności na potywirusy Ponad połowa ma charakter recesywny i stanowi ok. 40% wszystkich znanych recesywnych genów oporności Znaczna część to zmutowane czynniki inicjujące translację, szczególnie izoformy eIF4E Zakład Biofizyki, IFD UW 8

9. Recesywne geny oporności na wirusy Potyviridae Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 9

10. eIF4E pszenicy Mutacje związane z opornością: Pieprz Pomidor Groch Sałata Jęczmień Wspólne Domena wiążąca eIF4G Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504 Zakład Biofizyki, IFD UW 10

11. Interakcja VPg-eIF4E • Dwa miejsca oddziaływania VPg z eIF4E • Region wokół kieszeni wiążącej kap • Region obrócony o 90º względem domeny wiążącej kap • Częściowe pokrycie się strefy interakcji eIF4E-kap z rejonem oddziaływania eIF4E-VPg • Precyzyjne kontakty optymalizowane dla danej pary VPg/eIF4E • Zdolność wirusów do przełamywania oporności • Koewolucja między gospodarzem pragnącym uniemożliwić wiązanie eIF4E-VPg a potywirusem usiłującym ten kontakt odzyskać Zakład Biofizyki, IFD UW 11

12. Pieprz (Capsicum spp.) Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 12

13. pvr1, pvr21, pvr22 • Allele tego samego genu kodującego eIF4E pvr1 – C. chinesepvr2 – C. annuum Przemianowanie pvr21 na pvr11 itd. • Oporność na Potato virus Y (PVY)i Tobacco etch virus (TEV) • Substytucje w allelach Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913 Zakład Biofizyki, IFD UW 13

14. Mutanty z pojedynczymi substytucjami • Zbadanie oddziaływania in-vitro z VPg różnych szczepów TEV i wiązania kapu Brak oddziaływania pojedynczego mutanta G107R z VPg potwierdzony in-vivo • Substytucja G107R odpowiedzialna za oporność na TEV T51A i P66T negatywnie wpływają na efekt uzyskany przez G107R • pvr1 + pvr22 – oporność na wszystkie cztery szczepy TEV Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913 Zakład Biofizyki, IFD UW 14

15. pvr1, pvr21 – pvr29 • Identyfikacja dodatkowych alleli pvr2 • Koewolucja między szczepami TEV i PVY a Capsicum spp. Znacznie więcej miejsc polimorficznych w sekwencjach kodujących niż w intronach Przełamywanie oporności poprzez odzyskanie kontaktu ze zmutowanymi eIF4E, a nie z innymi izoformami Zakład Biofizyki, IFD UW 15

16. pvr22 + pvr6 • C. annuum • pvr22 koduje funkcjonalne eIF4E(V67E, L79R i D109N) • pvr6 koduje niefunkcjonalne eIF(iso)4E Delecja w I egzonie (89-107)bp -> kodon stop po 51 aa Dodatkowo substytucje G268A, C483A i C537T 29 aa z zachowywanych aa na N-końcu (Białko niezmutowane - 202 aa) Brak residuów kluczowych dla wiązania kapu (m.in. ośmiu Trp) • Oporność na Pepper veinal mottle virus (PVMV): pvr2 – wrażliwy pvr6 – wrażliwy pvr22 + pvr6 – oporny • PVMV może zamiennie wykorzystywać eIF4E i eIF(iso)4E • Fenotyp roślin normalny -> Izoforma kodowana przez pvr6+ nie jest niezbędna do prawidłowego rozwoju Zakład Biofizyki, IFD UW 16

17. Pomidor (Lycopersicon spp.) Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 17

18. pot-1 • pot-1 ortologiem pvr2 Ta sama lokalizacja genomowa 86,6% identyczność sekwencji aa Oporność na PVY i TEV • Koduje eIF4E Substytucje: L48F, N68K, A77D i M109I Położenia mutacji powiązanych z opornością: pvr2, mo1, sbm1 Ruffel et al. (2005) Mol Gen Genomics 274, 346 Zakład Biofizyki, IFD UW 18

19. Groch (Pisum sativum) Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 19

20. sbm1 sbm11 sbm1+ sbm1 sbm11 sbm1+ sbm1 i sbm4 • Allele tego samego genu kodującego eIF4E Przemianowanie sbm4 na sbm11 • Oporność na Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV): sbm1 – oporny na PSbMV-P1, sbm4 – oporny na PSbMV-P4 • Mutacje w allelach: sbm1 W6L A73D A74D – G107R N169K sbm11– A73P A74D S77Δ – – Położenia mutacji powiązanych z opornością: pvr2 – kółka, mo1 – trójkąty • PSbMV wykorzystuje produkt sbm1+ przy multiplikacji i przemieszczaniu z komórki do komórki sbm1 – zapewne zablokowana replikacja, ale ruch z komórki do komórki obecny sbm11 – zapewne zablokowana multiplikacja, nie wiadomo czy jest przemieszczanie Gao et al. (2004) Plant J 40, 376 Zakład Biofizyki, IFD UW 20

21. Jęczmień (Hordeum vulgare) Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 21

22. rym4, rym5, rym6, eif4e1 • Allele tego samego genu kodującego eIF4E • Oporność na Barley yellow mosaic virus (BaYMV) i Barley mild mosaic virus (BaMMV) • Podobne strategie przeciwko Potyviridae u jednoliściennych i u dwuliściennych • Mutacje eIF4E jako stare ewolucyjnie geny oporności na wirusy Mutacje związane z opornością: Pieprz Pomidor Groch SałataJęczmień Wspólne Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504 Zakład Biofizyki, IFD UW 22

23. Rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana) Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 23

24. Mutanty A. thaliana • Null allele eIF4E1 -cum1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie -T-DNA insercja w I intronie • Null allele eIF(iso)4E -AteIF(iso)4E-1 – insercja tranpozonu Spm w II egzon -lsp1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie (kodon 63) -lsp1-2 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120) -lsp1-3 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120) i punktowa mutacja w I intronie • Null allele izoform eIF4G Pojedyncze T-DNA insercje w geny: AteIF4G, AteIF(iso)4G1 i AteIF(iso)4G2 Sato et al. (2005) FEBS Letters 579, 1167 Lellis et al. (2002) Current Biol 12, 1046 Zakład Biofizyki, IFD UW 24

25. Mutanty A. thaliana • Wrażliwość na potywirusy TEV-Tobacco etch virus PPV-Plum pox virus LMV-Lettuce mosaic virus CIYVV-Clover yellow vein virus TuMV-Turnip mosaic virus • Potywirusy preferują kompleksy eIF4E-eIF4G, które naturalnie tworzą eIF4F w komórce • TuMV VPg może wymiennie oddziaływać z obiema izoformami eIF(iso)4G Zakład Biofizyki, IFD UW 25

26. Nie tylko rośliny... • Calicivirus Ludzki wirus Norwalk (NV) i wirus Lorsdale, koci Feline calicivirus (FCV), mysi Murine norovirus (MNV)i inne Główna przyczyna pozabakteryjnych epidemicznych zapaleń żołądka i jelit na świecie (~85%) Zwierzęta – zaburzenia oddechowe, krwotoki, „koci katar” • Genom – RNA o dodatniej polarności, 7-8 kb Poliadenylowane i kowalencyjnie związane z VPg (12-13 kDa) Brak kapu i brak IRES • Dotychczas zauważono, że: • VPg oddziałuje z eIF4E, interakcja niewrażliwa na analogi kapu • Inhibicja kap-zależnej i IRES-zależnej translacji w RRL • Translacja wirusowego RNA zależy od jego kowalencyjnego powiązania z dojrzałym VPg, niewrażliwa na analogi kapu, wymaga eIF4A oraz: • FCV – hamowana przez 4E-BP, wymaga eIF4E i eIF4G zdolnego do wiązania eIF4E • MNV – niewrażliwa na 4E-BP, nie potrzebuje oddziaływania z eIF4E, ani interakcji eIF4E-eIF4G Zakład Biofizyki, IFD UW 26

27. Dziękuję za uwagę! Zakład Biofizyki, IFD UW 27