Sugársérülés diagnosztikája, dózisbecslésre alkalmas biodozimetriai módszerek

1. Sugársérülés diagnosztikája, dózisbecslésre alkalmas biodozimetriai módszerek Dr. Galántai Rita Ph.D MH Egészségügyi Központ Védelem Egészségügyi Igazgatóság Speciális Katonaorvosi és ABV Védelmi Intézet Sugárbiológiai Kutató Osztály, osztályvezető

2. - DNS sérülései - kromoszóma sérülései - mutációk - membrán károsodása - enzimaktivitás gátlása - mitózis egyes fázisainak késleltetése v. gátlása - sejtnövekedés gátlása - sejtpusztulás (apoptózis, nekrózis) - sejtek közötti kölcsönhatás változása - adott sejtpopuláció számának csökkenése v. sejtpopuláció eltűnése Ionizáló sugárzás károsító hatásai Sejtszintű Szövetszintű Szervezetszintű tünetek megjelenése

3. - van küszöbdózis - károsodás súlyossága a dózis növekedésével nő - sejten belüli - repopuláció (szöveti szintű) A sugárzás hatását számos tényező befolyásolja! (pl. sugárzás fajtája, elnyelt dózis, dózisteljesítmény, frakcionált – nem frakcionált besugárzás, részleges v. egésztest besugárzás, egyéni sugárérzékenység, stb.) Ionizáló sugárzás károsító hatásai Sztochasztikus hatások Determinisztikus hatások - nincs küszöbdózis - károsodás valószínűsége a dózis növekedésével nő (kis dózisok?) Javító mechanizmusok

4. - gyakran kérdéses, hogy történt-e besugárzás - fontos feladat a dózisbecslés → biodozimetriai módszerek - diagnosztika alapja: a sugárzás hatására bekövetkező sejt-, szövet- v. szervezetszintű (el)változások megfigyelése - a hatás megjelenéséhez szükséges minimális idő, dózis, dózistartomány - a hatás fennmaradásának időtartama - ismert-e a megfigyelt (el)változás dózisfüggése - mintavétel módja - minta eltarthatósága - mintavétel és mérés elvégzése között rendelkezésre álló idő - eltárolható-e a feldolgozott minta ismételt vizsgálat céljából - a módszer elvégzéséhez szükséges idő - a módszer elvégzéséhez szükséges személyi és tárgyi feltételek , költségek - a vizsgált (el)változás „háttér” v. „alap”értéke Sugárhatás diagnosztikájának sajátosságai Kérdés: melyik (el)változást vizsgáljuk?

5. - a besugárzást követően rövid időn belül jelenjen meg a vizsgált (el)változás - a vizsgált hatás kiváltására alkalmas dózistartomány széles legyen →alacsony- és nagy dózisok egyaránt vizsgálhatók - a vizsgált (el)változás hosszú ideig maradjon fenn → retrospektív dozimetria lehetséges - az elváltozás mértéke legyen arányos a dózissal - mintavétel legyen egyszerű, gyors, ne terhelje túlzott mértékben a vizsgált személyt, helyszíni mintavétel lehetséges legyen - a mintavétel és mintafeldolgozás között hosszabb idő is eltelhessen (minta szállítása) - a feldolgozott minta hosszabb idő után szükség esetén újra megvizsgálható legyen - a módszer elvégzése rövid időt vegyen igénybe - a módszer legyen alacsony költségű, elvégzése ne igényeljen speciális gyakorlatot, könnyen elsajátítható legyen - a vizsgált (el)változás csak ionizáló sugárzás hatására jelentkezzen Jelenleg nem ismert olyan vizsgálati módszer, amely a felsorolt elvárások mindegyikének eleget tesz. A sugárzás hatásának vizsgálata több vizsgálati módszer eredményének komplex elemzése alapján lehetséges. Optimális vizsgálati módszer jellemzői

6. - prodromális szak: hányinger, hányás és rossz közérzet tünetek kialakulásának és fennállásának ideje összefügg az elszenvedett sugárdózissal, - látencia szak időtartama a dózis növekedésével párhuzamosan csökken Hátrányai: - nem specifikus tünetek, nem minden besugárzott személynél jelentkeznek - csak durva dózisbecslésre alkalmas - a megfigyelt időtartamok egyéb betegségek vagy sérülések társulása esetén jelentősen módosulhatnak - küszöbdózis ~1 Gy (alacsony dózisú besugárzásokat nem jelzi) Sugárterhelés becslése klinikai megfigyelések alapján Akut sugárbetegség tünetei hányás súlyossága, hányási reakciót produkáló egyének aránya a dózissal nő Táblázat forrása: NATO Kézikönyv az ABV védelmi műveletek egészségügyi vonatkozásairól (nukleáris) (AMedP6 vol.1.) Fordította: Dr. Horváth Győző ny. o. alezredes

7. csontvelő működés depressziója → perifériás vérkép változása - a vérsejtszám csökkenés üteme és mértéke dózisfüggő - különböző sejtvonalak besugárzás okozta depressziójának időbeli változása eltérő - elsőként limfocita szám csökken Hátrányai: - kombinált sérüléseknél a limfocitaszám nem megbízható indikátor - fertőzés párhuzamos fennállása módosíthatja a vérkép változásának időbeli alakulását - dózistartomány: 2-6 Gy (alacsony dózisú besugárzást nem jelzi) Hematológiai paraméterek sugárzás hatására bekövetkező változása

8. Melyik sejttípust vizsgáljuk? Biodozimetriai módszerek során leggyakrabban a perifériás limfocitákat vizsgálják - egyik legsugárérzékenyebb sejttípus - hosszú életidő - mintavétel (vérvétel) egyszerű, gyors, nem terheli meg a pácienst - a perifériás limfociták 99,8 % nem osztódik, de mitózisuk in vitro körülmények között stimulálható - folyamatos a keveredés a vérben keringő és a szervezet más szerveiben (lép, nyirokcsomók) lévő limfociták között →a perifériás limfocitákban megjelenő elváltozások az egésztest besugárzásról szolgáltatnak információt Limfociták vizsgálatán alapuló módszerek hátrányai: - módszer alkalmazhatóságának felső dózishatára ~ 7 Gy, efölött a limfociták száma rohamosan és drasztikusan lecsökken - lassú mitózis miatt legalább 48 órán keresztül kell tenyészteni - nagyobb dózisok hatására limfociták mitózisa lelassul → hosszabb tenyésztési idő - alimfociták hamar elveszítik életképességüket → mintát kb. 24 órán belül fel kell dolgozni - részleges (test)besugárzás (dózis inhomogenitás) esetén a dózis alulbecslése Sejtszintű változások vizsgálatán alapuló módszerek

9. - „gold standard” módszer - akkreditált eljárás (ISO 19238) - in vivo és in vitro besugárzás hatására kialakuló dicentrikus kromoszómák száma jól korrelál → in vitro dózis-hatásgörbe alapján dózisbecslés lehetséges - alacsony háttérérték (~ 1 dicentrikus kromoszóma/1000 sejt) - érzékenység 0,1-0,2 Gy Hátrányai: - kiértékelés nagy gyakorlatot igényel - egy minta kiértékelése egy személynek 2-3 napot vesz igénybe (optimális 500 sejt vizsgálata) → sejttenyésztéssel együtt kb. 7-8 nap - automatizálás nehézkes (alakfelismerő szoftver kisméretű, bonyolult struktúrák felismerésére) - a dicentrikus kromoszóma instabil kromoszóma aberráció, száma kb. 1 év felezési idővel exponenciálisan csökken → retrospektív vizsgálat? Kromoszóma aberráció vizsgálata Acentrikus fragmentum Dicentrikus kromoszóma

10. M. Fenech, M. Kirsch-Volders, A. T. Natarajan, J. Surralles, J. W. Crott, J. Parry, H. Norppa, D. A. Eastmond, J. D. Tucker and P. Thomas: Molecularmechanisms of micronucleus, nucleoplasmicbridge and nuclearbudformationinmammalianand human cells. Mutagenesis, 26, 125–132, 2011. Mikronukleusz gyakoriság vizsgálat Mikronukleusz kialakulása: asejtosztódássoránegykromoszómafragmentumvagyteljeskromoszómanemkerültátegyikutódsejtmagbasem Oka: kromoszóma fragmentációés/vagyosztódási orsókárosodása Cytochalasin B Mitózis mikronukleuszok

11. - in vivo és in vitro besugárzás hatására kialakuló mikronukleuszok száma jól korrelál → in vitro dózis-hatásgörbe alapján dózisbecslés lehetséges - érzékenység 0,2-0,3 Gy - kiértékelés könnyen megtanulható, gyorsabban kivitelezhető (500-1000 binukleáris sejt vizsgálata kb. 1-2 nap) - automatikus adatfeldolgozás bevezetése egyszerűbb Hátrányai: - magas alapérték, amely függ pl. kortól, nemtől, diabetes mellitusban emelkedett, kémiai ágensek hatására is létrejöhet DE! citoplazma hidak (eredet: dicentrikus kromoszóma) kimutatásával ionizáló sugárzásra specifikussá tehető, érzékenység 0,1–0,2 Gy-re csökkenthető vagy kiegészítés centromer kimutatással (ionizáló sugárzás hatására leginkább centromer negatív mikronukleuszok keletkeznek), érzékenység ~0,1 Gy-re csökkenthető) - limfociták tenyésztése szükséges → minta feldolgozása kb. 6-7 napot igényel - számlálási kritériumok eltérése laboratóriumok közötti különbségekhez vezethet - mikronukleuszok száma kb. 1 év felezési idővel exponenciálisan csökken → retrospektív vizsgálat? Mikronukleusz gyakoriság vizsgálat

12. - DNS egyszáltörés vagy kettős száltörés kimutatására szolgáló "egy sejt gélelektroforézis" eljárás - sejtmagok egyenkénti fluorescens mikroszkópos analízise - kvantitatív értékelés: agarózban elmozdulni képtelen DNS-t tartalmazó fej (head) és az elektromos térben az anód irányába elmozdulni képes DNS fragmentumok által kialakított csóva (tail) fluoreszcencia intenzitás arányainak meghatározása - kiértékelésre alkalmas szoftver rendelkezésre áll - dózis-hatás összefüggés lineáris → főként DNS javító mechanizmusok vizsgálatára, és egyéni sugárérzékenység vizsgálatára alkalmazzák Comet assay - nincs szükség a limfociták tenyésztésére (vizsgálat elvégzése kb. 2 nap) Hátrányai: - nem specifikus az ionizáló sugárzás által okozott DNS lánctörésre - DNS javító mechanizmusok miatt a DNS fragmentumok száma időben gyorsan csökken, a módszerrel csak néhány órán át mutatható ki a jelenlétük → elsősorban tervezett besugárzás esetén (pl. sugárterápia) alkalmazható

13. - DNS kettős száltörés (DSB) jelenleg legérzékenyebb vizsgálata - H2AX hiszton fehérje DBS kialakulásának hatására perceken belül foszforilálódik (Ser139) → gamma-H2AX - gamma-H2AX fókuszok kezdeti sejtmagonkénti száma arányos a DBS számával - immuncitokémiai vagy áramlási citometriás vizsgálatok - immuncitokémiai vizsgálat: - több ezer gamma-H2AX/DSB → DSB-k egyenként megjeleníthetők - gamma-H2AX fluoreszcens fókuszok eloszlásának megfigyelése, megszámlálása lehetséges - fókuszok számlálása könnyen automatizálható - áramlási citometriás vizsgálat gyorsabban kivitelezhető Gamma-H2AX vizsgálata

14. - nagyon érzékeny módszer, sugárzást követő rövid időn belül akár ~0,001 Gy elnyelt dózis kimutatható - gamma-H2AX áramlási citometrás vizsgálata 100-szor érzékenyebb módszer DSB kimutatására, mint a Comet assay - dózis-hatás összefüggés széles dózistartományban lineáris in vitro és in vivo besugárzásoknál egyaránt - gamma-H2AX fókuszok néhány perccel a besugárzást követően kimutathatók Christophe E. Redon, Jennifer S. Dickey, William M. Bonner, Olga A. Sedelnikova: γ-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 2009 ; 43(8): 1171–1178. Gamma-H2AX vizsgálata

15. Hátrányai: - nem specifikus az ionizáló sugárzás által okozott DNS lánctörésre - immuncitokémiai vizsgálatoknál "manuális" számlálás különösen 0,1 Gy besugárzás felett lassú - számlálási kritériumok eltérése laboratóriumok közötti különbségekhez vezethet - gamma-H2AX háttérérték sejttípustól függ - gamma-H2AX fókuszok száma besugárzást követően időben csökken → dózis-hatás görbét besugárzást követő különböző időpontokra szükséges elkészíteni DE! - vérmintát jégen tárolva gamma-H2AX fókuszok száma hosszabb időn át állandóan tartható - haj vizsgálata??? - gamma-H2AX fókuszok sugárzást követő időbeli változása a javító mechanizmusok és a sugárérzékenység vizsgálatára használható Gamma-H2AX vizsgálata

16. Eddig bevezetett módszerek: - mikronukleusz teszt - kromoszóma aberráció vizsgálat - Comet assay - in vitro dózis-hatás görbe felvétele Co-60 γ-sugárzásra (Gammatron-3 készülék) mikronukleusz teszthez és kromoszóma aberráció vizsgálathoz megtörtént Emődy Katalin kolléganőnk munkája Biodozimetriai vizsgálatok az MH EK Sugárbiológiai Kutató Osztályon

17. Nehézségek: - osztály személyi állományának létszámcsökkenése - tárgyi feltételek jelentős része az Országos "Frédéric Joliot-Curie" Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutató Intézettel (OSSKI) folytatott együttműködés keretében áll csak rendelkezésre Biodozimetria fejlesztésének tervezett irányai: - dózis-hatás görbék kiértékelő személytől való függésének vizsgálata - dózis-hatás görbék felvétele további kis LET értékű sugárzásokra - mikronukleusz teszt és kromoszóma aberráció vizsgálat feldolgozásának részleges automatizálása → kiértékelő szoftver fejlesztése (FLÜ-vel együttműködve) - immuncitokémiai vizsgálaton alapuló gamma-H2AX kimutatás bevezetése - bevezetett módszerek segítségével kémiai ágensek és ionizáló sugárzás kombinált hatásainak vizsgálata Biodozimetriai vizsgálatok az MH EK Sugárbiológiai Kutató Osztályon

18. Köszönöm a figyelmet!