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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione
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PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer
PCR da DNA genomico
Vettori dA:dT 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’
PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI BamHI
Proteine di fusione prom Tag o rep. term cDNA trascrizione traduzione
Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide
Soluzioni di caricamento • Aumentano la densità del campione • Colorano il campione • Rendono visibile la corsa elettroforetica
Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi
Marcatori di peso molecolare HindIII
Recupero DNA da gel • Elettroeluizione • Agarosio “low melting” • Solubilizzazione agarosio
Metodi di sequenziamento • Sanger (enzimatico) • Maxam e Gilbert (chimico)
Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 32P 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide
Fasi di un progetto di sequenziamento • clonaggio e preparazione del DNA • reazioni di sequenza • elettroforesi su gel di poliacrilammide • interpretazione e raccolta dati
Strategie di sequenziamento • Primer specifici consecutivi • Delezioni progressive • Frammenti casuali (shotgun)