Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010

1. Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010 Ingegneria animale e animali transgenici

2. Manipolazione genetica tradizionale

3. Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE

4. Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a quella moderna? 1967: Scoperta della DNA ligasi 1968: Scoperta degli enzimi di restrizione 1972: Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di plasmidi

5. Animale Transgenico:animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno Transgene:frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

6. Metodi di Ingegneria animale

7. Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale Transgenesi standard 1 Gene Targeting 2 Clonazione 3

8. Transgenesi standard 1 Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata • SCOPO: Guadagno di funzione • CARATTERISTICA: inserzione random, casuale

9. Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due pronuclei della cellula uovo fecondata

10. La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie

11. La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie • Cocktail ormonale per la superovulazione: • PMS (pregnant mares serum) • HCG (human chorionic gonadotropin) Raccolta degli oociti fecondati Accoppiamento ♀ ♀ ♀ ♂

12. La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Costruzione del transgene Amplificazione del transgene Purificazione del transgene

13. La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida ♀ 100-200X ♀ pseudogravida ♂ vasectomizzato

14. La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Estrazione DNA dalle code della progenie Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot M C 1 2 3 4 5 C 1 2 3 4 5

15. L’inserzione del transgene è casuale • RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA • Non si sa dove si è localizzato il transgene; • Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione; • Guadagno di funzione o perdita di funzione? “Incrociamo le dita!!”

16. Gene Targeting 2 • Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells • SCOPO: Perdita o modifica di funzione • CARATTERISTICA: inserzione mirata

17. La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene targeting AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA X X AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA Gene inattivo

18. La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie

19. Sequenze di ricombinazione Omologa Gene non attivo Tk - thymidine kinase Neor – resistenza alla Neomicina La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti Preparazione del transgene Elettroporazione

20. La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Trattamento con neomicina e ganciclovir No integrazione X Integrazione sito-specifica (1/1000) Sequenze di ricombinazione Omologa Gene non attivo Tk - thymidine kinase Neor – resistenza alla Neomicina Integrazione random X

21. La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie ES inserite in una blastocisti di topo nero

22. La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Topo “chimera”

23. L’inserzione del transgene è mirata • RICOMBINAZIONE OMOLOGA • Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene; • Problemi: espressione tempo e spazio specifica? “Obiettivo raggiunto!”

24. Clonazione 3 • Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato • SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

25. I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer

26. Il materiale genetico viene copiato in toto • Nuclear Transfer • Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere ingegnerizzate prima del reimpianto.

27. Altre tipologie di Ingegneria animale

28. Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in ingegneria animale Knockout condizionali 1 Animali reporter 2

29. Knockout condizionali 1 • Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo • SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.

30. Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE Gene da excidere

31. Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica:topi LID (liver IGF1 specific deficient) Esone 4 Cre X Promotore dell’albumina LoxP X CRE CRE 80% IGF-I plasmatico

32. Animali reporter 2 • Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile • SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare

33. La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi Sequenze regolatorie • Gene ESOGENO • Emivita breve • Facilmente detectabile

34. Esempio: il topo reporter ERE-Luc MAR ERE X2 Tk Luciferasi MAR Transgene inserito nel topo ERE-Luc

35. Applicazioni pratiche dell’ Ingegneria animale

36. Transgenesi standard Gene targeting Clonaggio KO condizionale Animale reporter Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Modelli di patologia umana 2 Produzione di biofarmaci 3 Screening di farmaci 4 Produzione di organi per xenotrapianti 5

37. Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard Delezione di un gene tramite gene targeting Palmiter et al, Nature, 1982

38. ESTROGEN RECEPTOR KNOCKOUT MICE Couse & Korach, Endocrine Reviews, 1999

39. Modelli di patologia umana 2 • Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard: • Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori • Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità • β-globina umana: talassemia • Recettore LDL: aterosclerosi • APP umana: morbo di Alzheimer • Delezione di un gene tramite gene targeting: • Apolipoproteina E: aterosclerosi • Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher • CFTR umana: fibrosi cistica • […]

40. Esempio: modelli di overespressione di APP umana per lo studio della malattia di Alzheimer Lord A, Neurobiol Aging, 2006

41. Produzione di biofarmaci 3 + Emoglobina + Insulina + tPA + GH Produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici

42. Pro/contro del “biopharming” • Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule. • Costo • Adattabilità alle richieste • Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale • Raccolta: facile purificazione dal latte • Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici • Attesa della lattazione • Inserzione casuale: può causare problemi all’animale

43. Screening di farmaci 4 • L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo REPORTER Promotore attivato

44. Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere lo screening di farmaci? • Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo • Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni • Permettere la misurazione della minima dose efficace • Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche

45. Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale

46. Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico

47. Produzione di organi per xenotrapianti 5 Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi X Rigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)

48. Un maiale ci salverà??