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Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevis

Fisiolog í a del Sistema Nervioso 2006. Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevis. Dra. Eleonora Katz Dra. Paola Plazas. Se realiza el viernes 7 de abril de 9.30 a 13 hs y de 14 a 17.30 hs en el INGEBI: Vuelta de Obligado 2490. Procedimiento.

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Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevis

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Presentation Transcript

  1. Fisiología del Sistema Nervioso 2006 Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevis Dra. Eleonora Katz Dra. Paola Plazas Se realiza el viernes 7 de abril de 9.30 a 13 hs y de 14 a 17.30 hs en el INGEBI: Vuelta de Obligado 2490.

  2. Procedimiento 4. Registro de corrientes iónicas con TVC 1. Preparación 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

  3. LB + ampicilina 1. Preparación de cRNA Amplificación del plásmido

  4. Purificación del Plásmido (lisis alcalina) 1. Tris+EDTA (pH 8) + Rnase A 2. NaOH + SDS 3. Kac (frío) sobrenadante Buffer de lavado Plásmido ssDNA Restos células KDS Lavado EtOH + DNA se redisuelve

  5. Tratamiento con Proteinasa K + Extracción con Fenol-cloroformo SP6 ori amp T7 inserto 3’UTR 5’UTR Templado para transcripción in vitro Linealización y preparación del templado X

  6. SP6 ori amp T7 inserto 3’UTR 5’UTR AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA Transcripción in vitro T7 RNA pol T7 RNApol rATP;rCTP;rUTP:rGTP CAP Buffer

  7. Purificación del plásmido Digestión con Nhe I Síntesis de cRNA Geles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNA

  8. Procedimiento 4. Registro de corrientes iónicas con TVC 1. Preparación 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

  9. Anestesiadas con ácido 3-aminobenzoico etil éster Remoción quirúrgica de los oocitos 2. Aislamiento de los oocitos

  10. Lóbulos abiertos Polo animal Polo vegetal Pueden observarse los oocitos en distintos estadios de desarrollo Lóbulos ováricos Los lóbulos estan formados por oocitos rodeados de tejido conectivo altamente irrigado (gran cantidad de vasos sanguíneos).

  11. Se eliminan las células foliculares Diámetro del oocito: 1-1.2mm

  12. Procedimiento 4. Registro de corrientes iónicas con TVC 1. Preparación 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

  13. 3. Inyección del cRNA a los oocitos

  14. AAAAAAAAAAAA Biosíntesis de la proteína de interés a partir del cRNA por el oocito 3’UTR 5’UTR

  15. Expresión de receptores nAChR a9a10 en la membrana del oocito … luego de 3 días

  16. Procedimiento 4. Registro de corrientes iónicas con TVC 1. Preparación 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

  17. 4. Registro de corrientes iónicas con TVC

  18. Cl - Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ BAPTA Canales endógenos del oocito • ICl activada por Ca2+ (expresión elevada) • Canales activados por estiramiento (expresión elevada) • receptores mACh (muscarínicos) • Canales de K+ activados por Ca2+ (expresión baja)

  19. a10 a10 a9 a9 a10 Elgoyhen et al. 1994 a9 a9 a9 a9 a9 El receptor nicotínico a9a10 1960s -1990s AChR ? Elgoyhen et al. 2001

  20. El receptor colinérgico nicotínico a9a10 es una canal iónico K+ K+ K+ K+ ACh Vsostén = -70mV Ca2+ Na + Na + Na + Na Na + +

  21. a10 a10 a9 a9 a10 Trabajo en el laboratorio 1. Inyeccción del cRNA de interés a los oocitos (mostración) 2. Fijación de voltaje con dos microelectrodos en oocitos control e inyectados con cRNA de las subunidades nAChR a9 y a10 3. Registro de corrientes evocadas por ACh 4. Efecto de la nicotina 5. Evaluación de la permeabilidad al Ca2+ del nAChR a9a10 por la activación secundaria de la corriente de cloro activada por Ca2+ en soluciones extracelulares con y sin Ca2+.

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