G enetički inženjering -tehnologija rekombinantne DNK

1. Genetički inženjering-tehnologija rekombinantne DNK

2. OSNOVE MOLEKULARNE GENETIKE genom ćelija hromozomi geni Geni sadrže instrukcije za stvaranje proteina DNK proteini Proteini deluju pojedinačno ili udruženo u kompleksu u obavljanju različitih ćelijuskih funkcija

3. Nove tehnologije • Genetičko inženjerstvo (tehnologija rekombinovane DNK) • Predstavlja sintezu molekularne genetike, biohemije i mikrobiologije. • Rekombinovana DNK predstavlja mol DNK čiji se delovi dobijeni iz različitih organizama veštački spajaju. Na taj način dobijaju se hibridni organizmi koji se nikada ne bi pronašli u prirodi.

4. Nove tehnologije Tehnologija rekombinantne DNK obuhvata veći broj tehnika: • Upotreba restrikcionih endonukleaza (enzima) • Kloniranje DNK (PCR) • Hibridizacija nukleinskih kiselina • Sekvencioniranje nukleotida • Genetičko inženjerstvo

5. Restrikcioni enzimi Restrikcioni enzimi deluju kao “molekulske makaze” Prvi restrikcioni enzimi otkriveni su kod bakterija i imali su ulogu da “pobede” viruse seckajući njihove gene.

6. Restrikcioni enzimi Nizovi nukleotida koji prepoznaju enzimi (restrikciona mesta) su najčešće PALINDROMI. To su dvostruko simetrični nizovi nukleotida u dvočlanoj DNK . Danas je komercijalno dostupno oko 200 restrikcionih enzima.

7. Kloniranje DNK • Tehnike koje se koriste za izolovanje pojedinih gena iz hromozoma i njihovo ugrađivanje u mol DNK, koji se mogu uneti u ćeliju u kojoj će se autonomno replikovati umnožavajući ispitivani gen, poznate su kao KLONIRANJE

8. Kloniranje • Kloniranje podrazumeva umnožavanje-dobijanje velikog broja • gotovo istovetnih kopija • Donedavno ovaj termin je podrazumevao proceduru u kojoj se • reprodukcijom jedne ćelije izolovane iz populacije ćelija, dobijao klon,odnosno skup gotovo identičnih ćelija.

9. Kloniranje • Kloniranje jednog segmenta DNK obuhvata sledeći niz postupaka: • Isecanje željenog fragmenta DNK iz molekula DNK uz pomoć enzima (restrikcione endonukleaze) koji će preseći mol DNK na tačno određenom mestu. • Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim mol DNK koji ima sposobnost autonomne replikacije (vektori za kloniranje-plazmidi ili virusne DNK). Spajanje fragmenata DNK sa vektorom postiže se pomoću enzima DNK ligaze. • Unošenje rekombinovanog mol DNK u ćeliju domaćina čiji će enzimi obezbediti njihovu replikaciju – umnožavanje. • Indentifikacija ćelije domaćina u kojoj se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.

10. Kloniranje gena- izdvajanje gena DNK davaoca, njegovo umetanje u vektore (prenosioce) i ugrađivanje u organizam domaćina pomoću metoda genetskog inženjeringa. Gen davaoca može da se umnožu u velikom broju kopija u organizmu domaćina. Kloniranje gena omogućava proizvodnju neograničene kolićine proteina. Transfer i kloniranje (umnožavanje) insulin gena

11. Tehnike direktnog unošenja DNK • Elektroporacija- stvaranje privremenih pora u plazmalemi korišćenjem električnih impulsa. Fragmenti DNK (geni) kroz pore u plazmalemi ulaze u ćeliju domaćina. • Genetički pištolj- Male čestice plemenitih metala prekrivaju se odabranim genom i pomoću genetičkog pištolja unose se u dublje slojeve ćelije ili tkiva.

12. Mikroinjektiranje – uz pomoćmikropipeta vrlo malog prečnika (0.05-0.10 µm) unose se geni u jedro ćelije.

13. Kloniranje • Kloniranje animalnih ćelija danas je gotovo rutina • Ovakav vid kloniranja omogućio je: • perspektive za terapiju i lečenje naslednih bolesti • ispitivanje funkcije pojedinih gena • indentifikaciju regulatornih regiona koji kontrolišu ekspresiju gena • proizvodnju proteina koji se koriste u biotehnološkoj industriji i farmaciji • dobijanje transgenih životinja

14. Kloniranje – danas Reproduktivna tehnologija za produkciju genetički indentičnih individua. Klonalnelinije: Populacije individua koje su genetički ekvivalentne.

15. Postupak kloniranja sisara

16. KLONIRANJE KRAVA

17. Postupak transplantacije jedra

18. jedro U jajnu ćeliju sisara naslonjenu na tupu pipetu (levo) unosi se genetički materijal (jedro) diploidne ćelije tankom pipetom (desno)

19. “Dolly” • Škotska ovca – klonirana iz tkiva mlečne žlezde odrasle individue. • Pre nego što je nastala, naučnici su verovali da klonovi mogu biti produkovani samo iz nediferenciranog embronalnog tkiva. • Nastala je iz 276 pokušaja kloniranja

20. Dolly, prva klonirana ovca

21. `` Polly`` • Istraživacki tim koji je stvorio ovcu Dolly objavio je rodjenje druge klonirane ovce Polly koja je u svojoj genetskoj šifri imala prilagodjeni humani gen koji je ugradjen u fetus ovce u labaratorijskim uslovima.

22. Cookies and Cream, su dve klonirane krave Holstein rase. Dobile su zdrave potomke – muškog i ženskog pola na privatnoj farmi Infigen u SAD. To je farma sa najvećim brojem (165) kloniranih krava i ovaca.

23. Naučni tim sa južnokorejskog Univerziteta Gjeongsang promenio je gen odgovoran za boju kože mačaka. Zbog flourescentnog proteina u njihovim ćelijama kože, mačke s tom modifikacijom pod UV svetlom izgledaju crvenkasto. Kloniranje flourescentne mačke (2007)

24. Metod za kloniranje (umnožavanje) DNK K. Mullis – 1983. Osnovni princip PCR amplifikacije željenog segmenta DNK je oponašanje procesa DNK replikacije. Lančana reakcija polimeraze (PCR)

25. PCR • Za primenu PCR neophodni su: • DNK matrica (jednočlana DNK –denaturisani dupleks DNK) • Prajmer – kratke sekvence DNK sastavljene od 20-tak nukleotida koje služe za određivanje početka umnožavanja fragmenta DNK koga želimo da izolujemo. Na taj način počinje proces polimerizacije na tačno određenoj sekvenci DNK određenoj sa 2 prajmera, na svakom kraju po jedan (3’ i 5’). • Nukleotidi – gradivni blokovi • Enzim – DNK polimeraza – koristi DNK matricu za sintezu komplementarnog DNK lanca

26. PCR- DNA xeroxing Matrica Prajmeri Nukleotidi DNK polimeraza

27. PCR PCR- faze • Denaturacija – (90-95°C) Raskidanje vodoničnih veza između dva komplementarna lanca DNK pod uticajem temperature • Hibridizacija – (45-65°C) Uspostavljanje vodoničnih veza i vezivanje prajmera za razdvojene lance DNK • Elongacija (ampifikacija) prajmera – (72-75°C) Dobijanje velikog broja kopija željenog fragmenta pod dejstvom enzima DNK polimeraze.

28. Denaturacija

29. Hibridizacija i ekstenzija

30. Hibridizacija nukleinskih kiselina denaturacija hibridizacija detekcija

31. PCR analiza

32. DNK polimeraza • Taq polimeraza Termostabilana DNK polimeraza, dobijena iz termofilnih bakterija, ne razgrađuje se na visokoj temperaturi. • Taq polimeraza omogućila je automatizaciju procesa PCR u posebnim aparatima (Thermal cycler). Ciklus polimerizacije ponavlja se 25-45 puta. • Na ovaj način dobija se željena sekvenca DNK u velikom broju primeraka (približno 228, preko milijardu kopija) koja se dalje analizira da bi se odredila primarna struktura gena.

33. PCR je ciklična reakcija u kojoj se ponavljaju tri koraka: denaturacija, hibridizacija i elongacija. Na kraju trećeg ciklusa željena sekvenca je umnožena 8 puta.

34. PCR • Uspešnost PCR reakcije proverava se elekroforezom • Elekroforeza predstavlja metod u kojem se na posebnim gelovima od skroba, agara ili poliakrilamida uz pomoć struje konstantnog intenziteta (5V/cm) vrši razdvajanje i vizuelizacija kretanja nukleinskih kiselina i proteina. Slika 1. Određivanje varijanti A i B u genu za  -kazein primenom PCR-RFLP metode

35. PCR

36. PCR U određenim slučajevima za analizu amplifikovanog segmenta neophodno je uraditi i dodatne procedure kao što su: • HIBRIDIZACIJA (Souther blot) • DIGESTIJA RESTRIKCIONIM ENZIMIMA • SEKVENCIONIRANJE

37. SEKVENCIONIRANJE • Metod relativno jednostavnog i brzog određivanja redosleda nukleotida u DNK (primarna struktura) uz pomoć posebnog i vrlo skupog aparata-SEKVENCER

38. Princip rada DNK sekvenatora

39. DNK biblioteka • DNK biblioteka predstavlja kompletan genom nekog organizma u vidu fragmenata različitih dužina dobijenih u postupku kloniranja. • DNK BIBLIOTEKA-GENOMSKA BIBLIOTEKA u idealnom slučaju sadrži sve delove genoma jednog organizma. • Da bi se skratio postupak kloniranja nekog gena danas se konstruišu biblioteke u kojoj su zastupljeni samo geni i delovi gena koji kodiraju proteine. Ovakav način kloniranja podrazumeva da se iz ispitivanog tkiva izoluju ukupne iRNK koje će poslužiti za sintezu komplementarnih DNK (cDNK).

40. Korist i rizici kloniranja • Korist: • Povećanje genetske vrednosti individua • Povećanje uniformnostivelikog broja osobina • Rizik: • Smanjenje genetičke varijabilnosti • Povećanje inbridinga • Mogućnost da klonovi postanu patogeni i neotporni na stres i uslove okoline • Kloniranje nije uvek uspešno.

41. Transgene životinje • Unošenje gena (dela DNK) stranog porekla (druge životinjske vrste ili čoveka) u genom životinja u cilju trajne promene genetskog materijala koje će se preneti na potomstvo • Dobijene su transgene svinje, koze, ovce, ribe, miševi • Upotreba u naučnim istraživanjima i u komercijalne svrhre (proizvodnja proteina, lekova, organa, tkiva za transplantaciju I veca proizvodnja hrane)

42. Transgene životinje • 1983. R. Brinster ubizgao je je gene humanog hormona rasta u embrion miša (super miš). • 1984. Naučnici su spojili ćelije embriona koze i ovce dobili himeru, što je prvi primer ukrštanja dve razlicite životinjske vrste.

43. Transgene životinje • 1996. dobijena je transgena koza ``Grace`` sa genom koji je u stanju da proizvodi BR 96 monoklonalno antitelo koje se koristi u humanoj medicini • Ista biotehnološka kuća je napravila transgenu kozu koja proizvodi anti trombin (lek protiv zgrušavanja krvi). • 1997. stvoreno je transgeno tele po imenu `` Rosie`` ono je u stanju da proizvodi mleko sa alfa laktoalbuminom (humani protein kojim se hrane prevremeno rodjena deca) • Postoje i transgene svinje koje proizvode humani hemoglobin

44. Postupak dobijanja transgenih životinja

45. Dobijanje životinja sa poboljšanim osobinama za proizvodnju hrane • U Australiji genetičkim inženjeringom su stvorene nove rase svinja i ovaca koje imaju za oko 30% veći prirast i za nekoliko nedelja ranije dospevaju na trzište od tradicionalno gajenih rasa. • Genetički su izmenjene koke koje kvocaju (nose 20% manje jaja). Blokiranjem gena koji proizvodi hormon prolaktin prirodni materinski instinkt kvocanja je nestao a istovremeno je nosivost povećana.

46. Dobijanje životinja sa poboljšanim osobinama za proizvodnju hrane • Istraživaćki timovi rade na dobijanju lososa koji ne bi imao samoubilački nagon vec bi ostajao na otvorenom moru čime bi se povećala produkcija ove vrste riba. • Većina istraživanja sa ribama usmerena je na dobijanje klonova u cilju povećanja proizvodnje (plava revolucija u morskoj biotehnologiji naspram zelene revolucije u proizvodnji biljne hrane).

47. Primena rekombinovane DNK u farmaceutskoj idustriji • Somatostatin – prvi humani horman, proizveden u E.c. • Humani hormon rasta – E.c. • Humani insulin - E.c. • Interferon- antivirusna i delimično atikancerogena supstanca • Relaksin itd.

48. Vakcine protiv virusa • Postupak proizvodnje vakcina započinje gajenjem virusa u organizmu neke pogodne životinjske vrste ili u labaratorijskim uslovima. • Pre nego što se ubrizgaju u organizam čoveka virusi se usmrte ili oslabe. Imunološki sistem organizma na prisustvo stranih tela odgovara stvaranjem antitela. Njihovo stvaranje traje dugo ali oslabljeni ili umrtvljeni virusi neće naneti štetu organizmu dok imuni sistem bude bio potpuno spreman da odbije žive snažne viruse istog tipa pri njihovom kasnijem eventualnom prodoru u organizam.

49. Vakcine protiv virusa • Najvece poteškoce su kako i na koji način dobiti velike količine odredjenog virusa (npr. H1N1). • Virusi su jednostavne gradje (sastoje se iz genetičkog materijala uvijenog u protein). Imuni sistem prepoznaje virus samo prema spoljnim karakteristikama, dakle samo prema proteinskom omotacu. • Na osnovu ovoga genetičari proizvode vakcine tako sto u bakteriju uvode gen sa kodom za deo proteina iz proteinskog omotaca koji izaziva bolest (grip). Bakterije stvaraju samo virusni protein a ne i cele viruse.