Imunocytologická diagnostika leukemizovaných B-lymfoproliferací

1. Imunocytologická diagnostika leukemizovaných B-lymfoproliferací (aneb není lymfocyt jako lymfocyt)‏ D. Starostka, P. Mikula, L. Novosadová, *M. Bílý Oddělení klinické hematologie Nemocnice s poliklinikou Havířov, p.o. *Dept. of Haematology Craigavon Area Hospital, Craigavon, UK

2. WHO Classification of TumoursTumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (2001)‏ „Within each category, distinct diseases are defined according to a combination of morphology, immunophenotype, genetic features, and clinical syndromes. For each neoplasm, a cell of origin is postulated.“

3. Vývoj hematopoetických řad

6. Marker Struktura Funkce CD5 Transmembránový glykoprotein, 1 řet. 67 kDa CD72 ligand CD10 Integrální membránový protein, 100 kDa Neutrální endopeptidáza CD11c Transmembránový glykoprotein, 145-150 kDa Integrin - aX podjednotka CD19 Membránový glykoprotein, 95 kDa Regulace, aktivace a diferenciace B-lymfocytu CD20 Membránový protein, isoformy 33-37 kDa Regulace, aktivace a diferenciace B-lymfocytu CD21 Transmembránový glykoprotein, 145 kDa C3d receptor, EBV receptor, aktivace a proliferace B-lymfocytu CD22 Transmembránový glykoprotein, isoformy 130 a 140 kDa Aktivace a diferenciace B-lymfocytu, ztráta po aktivaci B-lymfocytu před stadiem plasmocytu CD23 Transmembránový glykoprotein, 45 kDa, asociace s MHC II. tř. Low-afinity receptor pro IgE CD25 Glykoprotein, 55 kDa Receptor pro IL-2 CD38 Integrální membránový glykoprotein, 45 kDa Enzym (NAD-glykohydroláza, ADP-ribosylcykláza, cyklická ADP-ribózo-hydroláza)‏ CD40 Glykosylovaný fosfoprotein, 44-48 kDa Receptor pro TNF CD79a/CD79b Glykoprotein, 33-45 kDa, asociace se SmIg Struktura BCR komplexu CD103 Dvouřetězcový heterodimer, 25 a 150 kDa Integrin - aE podjednotka CD138 Transmembránový heparan-sulfát-proteoglykan (Syndecan-1)‏ Adhesivní molekula FMC-7 Glykoprotein 105 kDa Regulace, aktivace a diferenciace B-lymfocytu ZAP-70 TCR-zeta asociovaný protein, 70 kDa Proteinová tyrosinkináza Antigeny B-lymfocytu

7. Expresní profil B-lymfocytu

8. Leukemizace lymfomů Detegovatelná přítomnost lymfomových buněk v periferní krvi spojená s postižením kostní dřeně • integrální součást klinického obrazu některých lymfoproliferací • častá u některých lymfoproliferací (odráží pokročilost choroby)‏ • u jiných lymfomů raritní

9. DLBCL Mediastinální LBCL Intravaskulární LBCL Primary effusion lymphoma Burkittův lymfom/leukémie Plasmocelulární dyskrázie (PCL)‏ Zralé B-lymfoidní neoplázie (WHO)‏ • B-CLL/SLL • B-PLL • HCL • MCL • FL • MZL (nodální, splenický, extranodální MALT-typ)‏ • LPL

10. Zralé periferní (postthymické) T-neoplázie (WHO)‏ • Leukemické/diseminované –T-PLL, T-LGL leukémie, ATL/L • Nodální – angioimunoblastický T-lymfom,periferní T-lymfom nespecifikovaný, anaplastický velkobuněčný lymfom • Kožní – mycosis fungoides,Sézaryho syndrom, primární kožní anaplastický velkobuněčný lymfom • Ostatní extranodální –extranodální NK/T-lymfom nasálního typu, s enteropatií asociovaný T-lymfom,hepatosplenický T-lymfom, subkutánní panniculitis-like T-lymfom

11. Diferenciální diagnostika leukemizovaných lymfoproliferací je imunocytologická • Cytomorfologická a imunologická variabilita - cytomorfologie (MG-GR)‏ - důkaz klonality (FCM)‏ - charakteristický imunofenotyp (FCM)‏ • Synergický diagnostický efekt směřující často ke konečné diagnóze

12. Y Y mab2PE mab1FITC Imunofenotypizace Imunologická typizace jednotlivých buněčných populací za využití vizualizované reakce antigenu s monoklonální protilátkou označe-nou fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.)‏ Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků): • Povrchová (membránová). • Intracytoplazmatická. • Nukleární (jaderná). Praktické provedení imunofenotypizace: • Průtoková cytometrie – multiparametrová analýza • Fluorescenční mikroskopie

13. Zdroje materiálu pro imunocytologickou diagnostiku • Periferní krev • Kostní dřeň • Tělesné tekutiny (punktáty a likvor)‏ • Suspenze buněk solidních tkání

14. Pracovní postup FCM imunofenotypizace • Stanovení buněčnosti vyšetřované suspenze • Pipetování vzorku • Značení MoAb • Inkubace • Lýza erytrocytů a promytí • Resuspenze v pufru (PBS)‏ • Analýza

17. 675BP FL4 (PC5)‏ 620BP FL3 (ECD)‏ 575BP FL2 (RD1)‏ 525BP FL1 (FITC)‏ Laser (Air-cooled Argon Ion Laser)‏ Detektor pro „Side Scatter“ 645DL 600DL 550DL 488BK Čočky upravující tvar paprsku „Beam Shaping Lenses“ 488DL Detektor pro „Forward Scatter“ Průtoková kyveta „High Sensitivity Quartz Flow Cell“

18. Monoklonalita v B-linii – restrikce lehkých řetězců Problém: gate

19. Imunofenotyp chronických B-lymfoproliferací

20. Rozdíly v imunotypu lymfomových buněk uzliny, KD a PK Lymfatická uzlina 48,0 % Kostní dřeň 23,4 % Periferní krev 6,0 %

21. BODY 1 0 MEMBRÁN. ZNAK SmIg (lehké řetězce)‏ slabá/střední pozitivita silná pozitivita CD5 pozitivní negativní CD23 pozitivní negativní FMC7 negativní pozitivní CD79b (dříve CD22)‏ slabá či max. střední pozit./negat. silná pozitivita Skórovací systém pro B – CLLMatutes E. et al.: The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia, 1994, 8, 1640-45

22. Analyzovaný soubor leukemizovaných B-lymfoproliferací– OKH Havířov • Období 1/2003-12/2005 • Vzorky periferní krve, celkem 192 vzorky od 192 pacientů • Nová diagnóza • Leukocyty 1.6 – 257.1 giga/l (Coulter STKS, Sysmex XTi)‏ • Zastoupení lymfocytů 0.30 – 0.98 numfr. (manuální diferenciální rozpočet)‏ • Cytomorfologie (MG, GR)‏ • Flow-cytometrie (přímá fluorescence, Coulter Epics XL, monoklonální protilátky Immunotech, Dako, Becton-Dickinson)‏ • CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD19, CD5, CD10, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38, CD11c, CD79b, FMC7, SmIg • Semikvantitativní stupeň exprese • Skóre dle Matutes et al. • Korelace exprese CD38 a mutačního stavu IgVH genu-B-CLL

23. Diagnóza Počet B-CLL 135 B-CLL/PLL 3 MCL 13 MZL (vč. SLVL)‏ 9 (1)‏ FL 3 HCL 7 vHCL 1 LPL 2 Blíže nespecif. B-NHL 10 MLUS 9 Zastoupení diagnóz dle WHO

27. Pan-B+, CD5+

28. Pan B+, CD5+

29. Pan B+, CD5+

30. Pan-B+, CD5-, CD10+

31. Pan-B+, CD5-, CD10-

33. Pan-B +++, CD10-, CD5-, CD103+++

34. Pan-B+, CD10-, CD5-

35. Pan-B+, CD10+, CD5-

36. Pan-T, CD8+

38. CD5 posit. CD20 high CD21 posit. CD22 M/H CD23 posit. CD25 posit. CD38 posit. CD79 high CD11c posit. FMC7 posit. LŘ high SmIg high B-CLL 98 6 58 8 84 12 12 7 15 2.5 2.5 2.5 MCL 100 100 38 46 0 8 31 100 15 46 100 100 LPL 0 0 0 0 0 0 100 0 50 0 100 B-NHL 28 100 38 94 0 0 22 83 16 50 94 89 Exprese povrchových markerů (%)‏

39. Významné diferenciálně diagnostické faktory leukemizovaných lymfomů‏ • Komplexní pohled na diagnózu, indolentní B-lymfomy • Cytomorfologie • Rozdílnost pojmů „pozitivita“ a „síla exprese“ při vyšetření imunofenotypu • Přítomnost CD5 (dominantní zastoupení B-CLL)‏ • Přítomnost CD23 (specifická pro B-CLL)‏ • Vysoká exprese CD20, CD79b a SmIg a středně silná či vysoká exprese CD22, positivita FMC7 (specifická pro non-B-CLL lymfomy)‏ • Přítomnost CD103 (specifická pro HCL)‏ • Přítomnost CD10 (specifická pro FL při „indolentní morfologii“)‏

40. Významné diferenciálně diagnostické faktory leukemizovaných lymfomů‏ • Malý dif.dg. význam CD19, CD21, CD11c, CD25, CD38 • Nespolehlivost exprese CD38 jako korelátu mutačního stavu IgVH genu • Matutes 4-5 u 90% B-CLL • Problematické stanovení klonality v T-linii • Velký význam cytomorfologie u T-lymfomů vzhledem k absenci unikátních imunofenotypů • Lymfomy šedé zóny existují i v době superspecializované diagnostiky (nové entity v rámci WHO klasifikace ?)‏

41. Děkuji za pozornost !