Diagnostika vírusových ochorení

1. Diagnostika vírusových ochorení

2. Virologická diagnostika - priama - zviditeľnenie vírusu a jeho aktivity vo vzorke: • Izolácia vírusov - používame živý bunkový model • Mikroskopia vírusu – elektrónová, imunofluorescenčná • Dôkaz antigénu zo vzorky (ELISA, Latex) • Dôkaz genetickej informácie (PCR, genetické sondy) - nepriama • Dôkaz protilátok v sére pacienta (sérologické reakcie)

3. Virologická diagnostika priamaizolácia vírusu • 1) fáza pomnoženiavírusu Vírusy nie je možné kultivovať na umelých médiách Replikujú sa v živej bunke Na izoláciu vírusov používame živé bunkové modely – kuracie embryo – tkanivové kultúry, – bunkové línie • 2) fáza detekcie - dôkaz vírusu alebo jeho aktivity v bunkovom modeli

4. Systémy na pomnožovanie a izoláciu vírusov • Ľudia • Zvieratá: kravy, hydina, myši, krysy, sajúce myšky • Kuracie embryo • Orgánové a tkanivové kultúry: - kultúry z orgánov, primárne tkanivové kultúry, - bunkové línie – diploidné, nádorové a imortalizované bunkové línie – HeLa bunky (bunky obvykle z nádorov,ktoré stratili schopnosť apoptózy – naprogramovanej bunkovej smrti a neustále sa množnia)

5. Pomnoženie vírusu v kuracom embryu a jeho dôkaz • Do kuracieho vajíčka tenkou ihlou cez škrupinu inokulujeme testované tkanivo, v ktorom chceme dokázať vírus a necháme pomnožovať 14 dní. Ak bol v tkanive vírus prítomný, pomnoží sa v ňom a • Embryo odumrie alebo • Vytvoria sa v ňom špecifické zmeny Prítomný vírus pomnožený v kuracom embryu dokazujeme ďalšími testami na dôkaz antigérnu (fluorescencia, ELISA, PCR, elektrónová mikroskopia)

6. Pomnoženie a dôkaz vírusu na tkanivových kultúrach • Testované tkanivo naočkujeme do izolovaného tkaniva ľudských alebo zvieracích orgánov – opičie obličky, fetálna pečeň • Vírus sa na nich pomnožuje • Rast vírusu a jeho typ identifikujeme – na základe viditeľných zmien buniek tkanivového modelu = cytopatický efekt (CPE) elektrónovou mikroskopiou, dôkazom antigénu (Latex, ELISA), dôkazom genetickej infomácie (PCR), neutralizačným testom – po pridaní špecifickej protilátky do modelu sa vírus nepomnoží), Dôkazom interferencie – niektoré vírusy sa nepomnožujú v prítomnosti iných

7. Pomnoženie a dôkaz vírusu na bunkových líniách • Testované tkanivo naočkujeme na bunkové línie • Bunkové línie: nádorové bunky, ktoré sa nekontrolovateľne delia aj na umelých povrchoch – laboratórne sklo, HeLa bunky... • Vírus sa na nich pomnožuje • Na identifikáciu pomnoženého vírusu použijeme: cytopatický efekt (CPE) elektrónovú mikroskopiu, dôkazom antigénu (Latex, ELISA), dôkaz genetickej infomácie (PCR), vírus neutralizačný test – Dôkazom interferencie –

8. ELISA • Na povrch polystyrénovej jamky je naviazaný antigén. Sérum, v ktorom hľadáme protilátky pridáme do jamky. Ak v sére je protilátka, naviaže sa na antigén, ktorý pevne lpie na povrchu jamky. Nenaviazanú protilátku odplaví při premývaní voda. • Pridáme ďalšiu protilátku (komerčnú označenú farbičkou, alebo enzýmom, ) proti hľadanej protilátke v sére. Ak je naviazan na platničku cez antigén, naviaže sa aj komerčná protilátky. • Túto potom môžme detekovať podľa zmeny farby.

9. Princíp ELISA testu

10. Dôkaz antigénu ELISA a IF testom • Tieto testy môžu byť nastavené tak, že na pevnom povrchu (jamka mikrotitračnej doštičky, povrch skíčka), je naviazaná špecifická protilátka proti vírusu, ktorý chceme dokázať (vo vzorke z kur.embrya, z tkanivovej kultúry). Po pridaní testovanej vzorky vzniká komplex Ab+Ag. Potom použijeme značenú protilátku proti komplexu a detekujeme ako v predošlom prípade.

11. ELISA test na detekciu protilátok alebo antigénu • Dôkaz protilátok – • vírusový antigén je naviazaný na povrch • Pacientovo sérum sa pridá a umožní sa mu väzba jeho protilátok na antigén na povrchu. • Nenaviazané sérum je odstránené premývaním. • S enzýmom konjugované protilátky proti ľudským imunoglobulínom sa pridajú • po inkubácii sa opäť nenaviazaný konjugát odstráni premývaním. • Pridá sa substrát, ktorý umožní farebnú reakciu enzýmu • Dôkaz antigénu – • antivírusové protilátky sú naviazané na povrch • pridá sa vzorka obsahujúca antigén – CSM, tkanivo, • nenaviazaný antigén je po inkubácii odstránený premývaním. • Pridajú sa antivírusové protilátky na vychytenie antigénu. • Pridajú sa s enzýmom konjugované protiláky proti komplexu • substrát, ktorý umožní farebnúú reakciu

13. Imunofluorescencia. Antigén je možné detekovať piamo naviazaním protilátok označených fluoresceinom alebo nepriamo za pouzžitia antivírusových protilátok a značenýžch protilátok proti imunoglobulínom

14. Imunofluorescencia lokalizuje herpesvírusom infikované nervové bunky v reze mozgu pri herpetickej encefalitíde

15. Imunofluorescencia

16. Elektronová mikroskopia

17. Latex aglutinácia • Na latexové čiastočky je naviazaná špecifická protilátka proti antigénom baktérie alebo vírusu. Po pridaní vzorky – moč, CSM, krv ....sa mikroorganizmus špecificky naviaže na tieto protilátky a tým aj na latexové čiastočky a dôjde k viditeľnej aglutinácii • Latexové čiastočky zvyšujú citlivosť. Stačí menšie množstvo mikroorganizmov, aby bolo možné voľným okom sledovať aglutináciu

18. PCR • Každý organizmus – aj mikroorganizmus – obsahuje jemu špecifickú sekvenciu aminokyselín • Pomocou enzýmov je možné túto sekvenciu „vystrihnúť“ a vo vzorke (tkanivo, embryo, moč, CSM....) nasyntetizovať na milionov kópii. • Tieto potom identifikujeme prostredníctvom „protilátky“ proti tejto sedkvencii – značenej enzýmom, fluorescenciou a pod.

19. PCR polymerázováý reťazová reakcia – je rýchlou metódou na pomnoženie – amplifikáciu známej DNA. Vzorka sa zmieša s termostabilnou DNA polymerázou, DN-trifosfátmi a 2 DNA molekulami špecifickými - primermi , ktoré sú komplementárne so zakončeniami cieľovej sekvencie, ktorú chceme amplifikovať. Zmes je zahriata a tým denaturovaná, schladená, čo umožní väzbu primeru na cieľovú DNA a jej namnoženie. Cykly sa opakujú 32 krát. Po prvom cykle sa amplifikujú len sekvencie, ktoré boli rozložené primerom Týmto je možné v krátkom čase 6 hodín, veľmi špecificky dokázať suspektný vírus alebo baktériu vo vzorke – napr. TBC v spúte ap.) Test je veľmi citlivý (nájde ihlu v kope sena), ale veľmi dôležitá je špecificita – aby nedošlo k amplifikácii inej NK

21. Genetické sondy • Na podobnom princípe pracujú genetické sondy. • Priamo v odobratom tkanive (ster z krčku maternice.....) sa identifikuje prítomnosť vírusu (napr.) prostredníctvom identifikácie jeho špecifickej sekvencia amínokyselín. Túto uskutočníme pridaním značenej protilátky ku tkanivu.

22. Dôkaz vírusom infikovanej bunky DNA sondou – Vírusom infikované bunky môžu byť lokalizované na histologických preparátoch z tkaniva prostredníctom DNA sondy. DNA sonda (obsahujúca asi 9 nukleotidov) Sonda sa pridá ku vzorke Vzorka je zahriata kvôli denaturácii DNA a schladená kvôli hybridizácii komplementárnej sekvencie. Celý systém je zviditeľnený reakciou enzým substrát

23. In situ lokalizácia CMV infekcie za použitia genetickej sondy. CMV infekcia obličkových tubulov je lokalizovaná označenou CMV špecifickou DNA sondou a zviditeľnená podobne ako pri ELISA teste reakciou enzým substrát.

24. Typy cytopatických efektov • Bunková smrť – zaguľatenie bunky, degenerácia, agregácia, strata schopnosti viazať sa na substrát • Charakteristické histologické zmeny: Inklúzne telieska v jadre alebo cytoplazme, marginácia chromatínu • Tvorba syncýcií: mnohojadrové obrovské bunky spôsobené vírusom navoden fúziou buniek • Zmeny povrchu buniek: Zmena expresie antigénu, hemadsorbcia (spôsobená expresiou hemaaglutinínov)

25. Cytopatický efekt HSV B HSV-1 infikované Vero bunky – okrúhle mnohojadrové bunky a strata jednovrstvovej organizácie bunkovej kultúry . A neinfikované Vero bunky

26. HSC indukuje CPE – A: V bioptickej vzorke je vidieť eozinofilné intranukleárne inklúzie s Halo a prstencom chromatínu v nukleárnej membráne B: Infikovaná bunka má malé kondenzné pyknotické jadro

27. Cytopatický efekt

28. Histologické farbenie na špecifické zmeny v tkanivách navodené vírusovou infekciou CPE Tvorba špecifických mikroskopických obrazov v tkanive infikovanom vírusom: mnohojaderné obrovské bunky viditeľné v pľúcach pacienta s morbilovou pneumóniou.

29. Histologické farbenie na špecifické zmeny v tkanivách navodené vírusovou infekciou Negriho telieska spôsobené infeciou vírusom besnoty v reze mozgu infikovaného pacienta

30. Histologickým farbením znázornené vírusovou infekciou zmenené bunky

31. Nepriama diagnostika • Dôkaz protilátok v sére • ELISA, IF - imunofluorescencia, RIA, • Neutralizácia, aglutinácia, hemaglutinácia, latexaglutinácia, KFR (komplement fixačná reakcia), imunodifúzia • Western blot

32. Sérologická reakcia • Antigén + protilátka v sére Komerčný hľadaná protilátka Typ reakcie je daný prostredím a nastavením testu (vo FR - aglutinácia, Ag naviazaný na latex - latexaglutinácia, na ery - hemaglutinácia, rozpustený v agari - difúzia, naviazaný na PE doštičku - ELISA, na nitrocelulózový papier - WB, na fluorescenčné farbivo - IF, radionuklid - RIA)

33. Princíp ELISA testu

35. Imunofluorescencia IFT • Na podložnom sklíčku máme antigén protilátky proti ktorému testujeme v sére. Pridáme sérum s hľadanou protilátkou, ktorá vytvorí pevný komplex. Pridáme ďalšiu protilátku - proti komplexu Ag a Ab vytvorenom na sklíčku - označenú fluoresceínom. Ak vznikol komplex antigén–protilátka-2.protilátka s fluoresceinom - vo fluorescenčnom mikroskope sledujeme fluorescenciu.

36. Princíp imunofluerescenčného vyšetrovania protilátok

37. Western blot • Na prúžku papiera je nanesená a elektroforézou rozložená antigénna štruktúra vírusu alebo baktérie. • Pridáme na prúžok sérum. Ak obsahovalo protilátky proti vírusu alebo baktérii naviažu sa zodpovedajúcom mieste prúžku. Po pridaní ďalšej protilátky proti komplexu ag-ab s farbičkou, sa zviditeľnia na prúžku. • Môžme oddiagnostikovať prítomnosť protilátok proti viacerým antigénom mikroorganizmu

38. Western blot Proteiny antigénu testovaného vírusu sú elektroforeticky separované nanesené na nitrocelulózový papierový prúžok. Ten sa potom inkubuje spolu s protilátkami – sérom –pacienta, premyje sa, aby došlo k odstráneniu nenaviazaných protilátok a potom reaguje s konjugátom protilátky proti komplexu ag-ab s naviazaným enzýmom. Sérum pacienta sa naviaže na antigény na nitrocelulóze len tam, kde identifikuje vlastný špecifický antigén k protilátke v sére. Tento test sa používa na vylúčenie nešpecifických reakcií ELISA testov napr. ako konfirmačný test pre HIV infekciu ap.