Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie

1. Praktische Oefeningen • MEDISCHE BIOCHEMIE • Prof. Dr. J. Van Bocxlaer • Apr. Ruben t’ Kindt • Apr. Michael Storme • Apr. Julie De Smet • Mr. Wim Goeteyn • Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

2. Overzicht • Doel • Algemene richtlijnen • Technieken • Uit te voeren proeven

3. Doel • = bepaling van endogene componenten in een • biologische matrix... • Bloed Urine Punctievocht Etc. • Serum / Plasma • Complicatie:vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig dikwijls in veel  conc. •  nood aanSELECTIVITEIT • SENSITIVITEIT • …om pathologische toestandenop te sporen en/of te bevestigen

4. Afname zonder • anticoagulans • STOLLING • Afname met • anticoagulans • GEEN STOLLING uitzakking of centrifugatie SERUM: helder supernatans PLASMA Prop: cellulair materiaal stollingsEW RBC, WBC • Bloed

5. Anticoagulans • = antistollingsmiddel • wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname Voorbeelden: NaF NaCitraat EDTA Heparine F- inhibeert de enzymatische activiteit Complexatie Ca2+ Prothrombinethrombine

6. Bepaling van… • een targetcomponent creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol... • een enzymactiviteit Alkalische fosfatase, LDH, …

7. Bepaling van een targetcomponent • Algemene strategie • Monster:ontdooien •  mengen ! • Deproteïniseren:= hogere structuren van proteïnen H2SO4, TCA, EtOH • Centrifugeren

8. Supernatans: = bovenstaande vloeistof moet steeds HELDER zijn! SpectrofotometrieFluorimetrie - na chemische kleurreactie bilirubine, glucose colorimetrisch Phenylalanine - na enzymatische omzetting • glucose enzymatisch

9. Bepaling van eenenzymactiviteit •  bepaling van targetcomponent • uitvoering op speciale spectrofotometers • rekening houden metchemische structuur • Michaëlis-Menten !!!! • meestal kinetische bepaling - overmaat substraat toevoegen - hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid of hoev. product gevormd/ tijdseenheid  spectrofotometrisch volgen - enzymactiviteit berekenen

10. Reactie- snelheid 0de orde:overmaat substraat bepalen van enzymactiviteit Conc. Substraat 1ste orde:overmaat enzyme bepalen van substraat (targetcomponent)

11. Algemene Richtlijnen Stalen !! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken niet schudden • 1 plasmastaal ( 9 mL) • gedurende volledig practicum bewaren • onmiddellijk na gebruik in de ijskast • niet in de zon laten staan • zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine breektaf o.i.v. licht)

12. 1 bloedstaalhematologie STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld Opmerking: Handschoenen!

13. Materiaal • Plastiek box • materiaal • lijst controleren bij begin practicum • Chronometers • KnikkersZelf meebrengen • Zilverpapier • Spectrofotometers • steeds aangeduid toestel gebruiken • ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken • cuvetten voorspoelen

14. Centrifuges • STEEDSsymmetrisch vullen Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water • STEEDScentrifugeerbuizen merken!     =   = 

15. Reagentia • Standaarden: • meestal 1 per groep • correcte concentratie gebruiken in de berekening • nooit voorspoelen met standaardoplossingen • contaminatie vermijden! • ijskast! • Producten aan weegschaal: • droog houden: deksels op potten!! • Vloeibare reagentia: • flessen afsluiten met juiste stoppen  contaminatie! • Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch slechts 1x uitvoeren)

16. Verslagen • Geen papieren verslagen meer • Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2) • Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden samen met staal geleverd.

17. Algemeen - Milieu - Veiligheid • Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten, microscopen!) • GEEN jassen, GEEN boekentassen • LABOJAS verplicht • VEILIGHEIDSBRIL • NIET met de mond pipetteren (peer) • MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten

18. Voorbereiding: • Dagelijks ondervraging mogelijk • Zowel schriftelijk als mondeling • Geen examenproef, dus GOED WERKEN • Resultaat practicum telt voor 25% mee in het eindresultaat van het opleidingsonderdeel Medische Biochemie !!!!

19. Technieken • Spectrofotometrie

20. Spectrofotometrie Lichtstraal van bepaalde energie ( E 1/ ) die door een oplossing wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie vertonen. De buitenste electronen van de moleculen worden door de EMS naar een hogere energietoestand gebracht. Intensiteit lichtstraal daalt. dI I0 Intensiteit I Afstand

21. - dI  I0met •  N* • via mathematische afleiding:Wet van Lambert-Beer • I0 • E = log = . M . l • I • E = extinctie •  = molaire extinctiecoëfficiënt • M = molariteit v/d oplossing • l = weglengte • I0 = oorspronkelijke intensiteit • N* = # absorberende deeltjes / cm2 doorsnede

22. I detector • Spectrofotometer: schematisch • - onderdelen 1. lichtbron (UV, of zichtbaar) • 2. golflengteselector • 3. cuvet (glas,plastiek of quartz) • 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel) • - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E • E = log 1 / T I0 1 2 3 4

23. Doel = Concentratiemetingen • 1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie • Ex Cx Ex Cx • = Est Cst Est Cst • 2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn Ex . Cst Est   Cx = E4 E3 E2 E1 y = ax + b Ex C1 C2 C3 C4 Cx

24. Proeven • Medische achtergrond • Praktische aspecten

25. HEMATOLOGIE • RBC of erythrocyten: • Aantal • WBC of leucocyten: • Aantal • Leucocytaire formule

26. Fysiologisch: bewoners hooggebergte of hoogtestage  O2-gebrek  EPO  Pathologisch: t.g.v. beenmerg- of niertumor Overmatig bloedverlies Hemolytische anemie Defecte bloedaanmaak RBC Anemie Polycythemie # RBC en/of Hb  # RBC en/of Hb 

27. WBC • Onmisbare rol in het afweermechanisme • Pathologie: LeucopenieLeucocytose # WBC < 4000 # WBC > 10000 Differentiatie  leucocytaire formule Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 

28. Praktisch • VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking • Tellen RBC: • Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas • Hayemopl.: bevat HgCl2 (GIFTIG) • Leucocytaire formule: • Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie • Microscopen: • Lenzen ev. schoonmaken met xylol • Voorwerpglaasje NIET raken met lens

29. Ureum- of ornithinecyclus Omzetting NH4+-ionen tot ureum in lever Minder toxisch Gemakkelijke eliminatie langs nier • N-bevattende eindprodukten  urine • Uremie nierfunctie testen UREUM • Degradatie van ANZ  afsplitsing a-NH2-groep trans- of de-aminatie-reactie • Elk metaboliserend weefsel produceert NH4+  toxisch

30. Praktisch • Proefbuizen afsluiten met knikker bediende • TIMING!!!

31. BILIRUBINE • Hb (MW: 64450): • Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens • Drager van O2 • Biodegradatie Hb (lever): • Splitsing in heem en globine • Proteïnedeel  proteïne-catabolisme • Heem bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces urine

32. Geelzucht of icterus Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v. levercelbeschadiging obstructie van de galafvoer • Bilirubine: lichtgevoelig zilverpapier • Enkel totaal bilirubine wordt bepaald • Diazo II en diazoreagens: zelf maken • Ijklijn: zie p. 37 Praktisch

33. CREATININE • Creatine: glycine + arginine + methionine belangrijke spierconstituent • Fosfocreatine: ° spieren in rust ogenblikkelijke E-leverancier voor spiercontracties cycliseert spontaan tot creatinine • Creatinine: nutteloos afvalprodukt uitscheiding door nier • Creatininemie o.a.nierinsufficiëntie

34. Praktisch • Creatinine stockstandaard :  frigo  nog verdunnen • MIN. 1u incuberen • Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden • Natriumtungstaat = natriumwolframaat

35. ELEKTROFORESE • %-samenstelling van de EW • Albumine • Diverse globulines (o.a.  -globulines immunologische reflex) afwijking: indicatie pathologie • Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse) Praktisch • Let op: elektroforesekamer in werking 220V reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer

36. GLUCOSE • Deonmiddellijke E-bronbij uitstek voor de cellen • bij overmaat: start glucose consumptie glycogenese, glycolyse, lipogenese • bij tekort: start glucose productie gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie • dirigenten: insuline + glucagon • Diabetes Mellitus of suikerziekte: • basisdefect: insuline • biochemisch: hyperglycemie glycosurie ketogenese en acidose •  klinische symptomen

37. Bepalingen • Hexokinasemethode: meest specifieke methode glucose enzymatisch hexokinase glucose glucose-6-P ATP ADP G-6-fofaat-DH glucose-6-P + NADP+ 6-fosfogluconaat + NADPH + H+ NADPH  spectrofotometrisch van NADP+ * Slechts 1 X per student * TIMING * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

38. Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson glucose colorimetrisch •  van eiwitten • kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen * arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

39. ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN • Frequent uitgevoerd in het klinisch labo • Soorten plasma-enzymen: • Plasma-specifieke • Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme conc plasma > conc cellen specifieke functie aanmaak in lever conc plasma  bij leverdeficiëntie specifieke voor weefsel of orgaan conc plasma bij celbeschadeging vb. ADH in levercellen

40. Alkalische fosfatase (ALP) • Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen • p-nitrophenylfosfaat p-nitrophenol • Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm • WWB 30°C • Opletten: bij 37° C denatureert ALP! Praktisch Niet te lang!