SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062

1. APLIKASIPOLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCRUNTUK DETEKSIWHITE SPOT SYNDROME VIRUSPADA KEPITING Dibawah bimbingan: Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi Ir. EviLiviawaty, MP • UNIVERSITAS PADJADJARAN • FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN • PROGRAM STUDI PERIKANAN • JATINANGOR SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062

2. LATAR BELAKANG...

3. PCR Konvensional • PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara in vitro. Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis.

4. Real Time PCR • Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut (Fatimi 2010). • Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk menghitung jumlah kopi DNA atau thresholdcycle (Ct) dari patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).

6. Pendekatan Masalah... Budidaya Udang Windu Mengalami penurunan produksi Penurunan mutu lingkungan Serangan penyakit Hama PCR Konvensional Deteksi Organisme carrier Kepiting Real Time PCR Hasil Penelitian

7. Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR. Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji Nested PCR. • Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.

9. Alat-Alat Penelitian

10. BAHAN-BAHAN PENELITIAN Metode PCR Konvensional Metode Real Time PCR

11. METODE PENELITIAN • Metode penelitian yang digunakan adalah metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan analisis data.

12. PROSEDUR PENELITIAN Isolasi Pengambilan Sampel Kepiting sebanyak 7 ekor dari setiap lokasi tambak Pemeriksaan dengan Real Time PCR Pemeriksaan dengan PCR Konvensional Amplifikasi Setting Profil PCR Preparasi Reagen PCR Elektroforesis Proses Real Time PCR Analisis Data Interpretasi Data

13. First Step PCR 8,5µl NFW x (jumlah sampel + 2)* 1µl F1 x (jumlah sampel + 2)* 1µl R1 x (jumlah sampel + 2)* 12,5µl Master Mix x (jumlah sampel + 2)* 23µl 23µl 23µl 23µl Kontrol Negatif 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid + sebagai kontrol positif

14. ELEKTROFORESIS

15. 1µl + 9µl NFW 1µl + 9µl NFW Pengenceran Standar Positif Pembuatan Campuran Reaksi Real Time PCR Stok 105 104 103 0.5µl Primer WSSV345 x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Probe WSSV296T x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Primer WSSV270 x (jumlah sampel +4)* 12.25 µl 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix x (jumlah sampel + 4)* 9 µl Rnase-free waterx (jumlah sampel + 4)* 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid kontrol + 105 2 µl plasmid kontrol + 104 2 µl plasmid kontrol + 103 2 µl NTC

16. Analisa Data... Data yang diperoleh dari hasil penelitian akan dianalisis secara deskriptif kualitatif yaitu membandingkan hasil DNA WSSV yang terdeteksi dengan menggunakan metoda PCR Konvensional dan Real Time PCR.

17. HASIL DAN PEMBAHASAN

18. PENGAMATAN GEJALA KLINIS Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.

19. Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom 1 SPEKTROFOTOMETER 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ELEKTROFORESIS

20. : 1 • Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Keterangan :

21. Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR Pengenceran Standar Kurva Kurva standar sampel asal tambak Pasekan memiliki nilai slope -4,45724, nilai efisiensi 67,63% dan nilai R2 mencapai 0.99398. Adapun persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.457x + 39.629 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji. y = -4.457x + 39.629 Kurva standar sampel sampel asal tambak Karangsong memiliki nilai slope -4.64589, nilai efisiensi 64,15% dan nilai R2 mencapai 0.99941.Persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.646x + 43.805 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji.

22. Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

23. Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

24. PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR Keterangan : 12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV) 2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV

25. KESIMPULAN DAN SARAN • KESIMPULAN • Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : • Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis dibandingkan dengan PCR konvensional. • Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus, Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax. • Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76 bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. • Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. • SARAN • Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis, serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.

26. TERIMA KASIH