A mikrobiológiai laboratórium felépítése, berendezései (GLP)

1. A mikrobiológiai laboratórium felépítése, berendezései (GLP)

2. A mikrobiológiai laboratórium felépítése • Mikrobiológiai laboratórium „légzsilip” előtérrel • Járulékos helyiségek: • előkészítő, • mérlegszoba, (táptalaj készítő és tároló ) • mosogató, • sterilező. A szűkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények és eszközök kezelését szolgáló helyiségektől.

3. Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó laboratóriumokban zajló főbb munkafolyamatok Táptalaj főzés (és sterilezés) Mintaelőkészítés Leoltás Inkubálás Kiértékelés Identifikálás Sterilezés Mosogatás Eszközök sterilezése Törzsfenntartás

4. A táptalajkészítés és -tárolás berendezései • Hőmérsékletkompenzációs pH mérő • Automata adagoló • Hűtőszekrény • Mérlegek • Desztilláló berendezés vagy ioncserélő gyantát tartalmazó patron • Főzőlap, vagy vízfürdő

5. Táptalajok típusai • - eredet (természetes, mesterséges, szintetikus) • - halmazállapot (szilárd, folyékony, félfolyékony) • - funkció (általános, szelektív, differenciáló)

6. Mintaelőkészítés berendezései • Homogenizáló berendezés: • régebben un. forgókéses homogenizáló berendezés • ma már (főleg az élelmiszer-mikrobiológiában) a Stomacher-készülék alkalmazása az általános • Rázókeverő • Fagyasztó

7. Mintaelőkészítés folyamata • CÉL: összetétele ne változzon meg • minta megfelelő hűtése (4 °C) közvetlenül a mintavételtől egészen a vizsgálatig. • mintavétel és a vizsgálat ideje között nem telhet el több, mint 24 óra • reprezentatív minta legalább 200 g ill. ml • A szilárd halmazállapotú minta: • fel kell aprítani és összekeverni. • az előkészített mintából 10  0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomacher-tasakba kell mérni, • 9-szeres mennyiségű hígítóoldattal kiegészíteni (A hígítófolyadék hőmérséklete 10-20°C) • hogenizálni. • A folyékony minta • a vizsgálati minta kivétele előtt alaposan át kell keverni, majd rövid ideig állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak. • Ezt követően a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 ml mennyiségéből el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál leírtakkal azonos módon. Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.

8. A steril munkavégzés berendezései(biológiai biztonsági szekrények) Cél: mikrobamentes környezet biztosítása. A laborban keletkező kis légörvények kivédésére I.- II.- III.-kategóriájú biológiai biztonsági szekrényeket alkalmazunk. I.- kategóriájú biológiai biztonsági szekrény

9. II.- kategóriájú biológiai biztonsági szekrény Lamináris box: A levegő szűrése révén mikrobamentes légteret biztosít a berendezés munkaterében. Elnevezését a lamináris (turbulenciamentes) légáramlás megvalósítása alapján nyerte. Előnye, hogy kis helyigényű, munkatere lehetővé teszi a steril munkát. HEPA (High efficiency particulate air) szűrő

10. II. - kategóriájú biológiai biztonsági szekrény A légáramlás iránya szerint megkülönböztetünk függőleges (vertikális) és vízszintes (horizontális) légáramlású lamináris boxokat.

11. III. - kategóriájú biológiai biztonsági szekrény Alkalmas nagyon veszélyes fertőző anyagok kezelésére • Hermetikusan zárt belső tér • A munkálatok a belső térben rögzített, karhosszúságú gumikesztyűk segítségével folynak. • Anyagok bevitele, csak légzáró zsilipen keresztül lehetséges • Az anyagok eltávolítása autoklávon vagy folyékony fertőtlenítőszerrel • töltött merítő tankon át történik.

12. Az inkubálás berendezései • Termosztátok: a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, kívánt hőmérsékletre beállítható szekrények. • Vízfürdő • Rázógépek: Főleg aerob mikroorganizmusok tenyésztésénél használják. Vízfürdős változatban, vagy légtermosztáttal egybeépítetten elterjedten alkalmazzák mikroorganizmusok laboratóriumi léptékű szaporítására.

13. Automata telepszámláló • 80%-al csökken a leolvasásra fordított idő • 600 lemezt olvas le óránként

14. A sterilezés

15. A sterilezés nedves levegővel I. • Autoklávok (sterilezés gőzzel, nyomás alatt) • táptalajok és szennyes (kontaminált) edények gőzzel való sterilezésére szolgáló eszközök • A táptalajok sterilezésénél figyelembe veszzük azok alkotóelemeinek hőérzékenységét és tömegét (1000 ml-nél nagyobb volumenben ne, ne töltsük színültig, kupakokat lazítsuk meg) • csomagolás nélkül eszközt, anyagot sterilizálni nem szabad • Az üzemeltetés lépései: • Vízfeltöltés (desztillált vagy ioncserélt vízzel) • Felfűtés • Légtelenítés (levegő eltávolítása a légtelenítő szelepen át-5perc, ha elérte a 100 °C-ot, ekkor a rakomány még csak 50-60°C-os) • Hőmérséklet-kiegyenlítés (a rakománybak el kell érnie az előírt 121°C, vagy 134°C hőmérsékletet) • Csírátlanítás (1AT – 121°C 30perc, de 15 minimum,, pl táptalajoknál 2AT – 134 °C 10 perc) • Túlnyomás megszüntetése, szárítás

16. Az autoklávok csoportosítása Típus szerint: egyfalú kettősfalú Működés szerint: kézi szabályozású részben automatikus automatikus Kivitel szerint: álló helyzetű fekvő helyzetű egyoldali kétoldali (ún. átadós rendszerű)

17. A sterilezés nedves levegővel II. Frakcionált sterilezés (tindallozás) Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkező endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gőzben. Általában hőérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hőkezelést, amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik. Ezért a sterilezendő anyagot vagy eszközt 3 napon át napi fél órára áramló gőzbe kell helyezni. Az első napon a hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további hőkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat.

18. A sterilezés nedves levegővel III. Sterilezés áramló gőzben A sterilezés áramló gőzben légköri nyomáson 100 °C-on 30 percen át történik. A behatási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a sterilezendő eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os hőmérsékletet. A sterilezésnek ez a módja végezhető autoklávban (fúvatás), vagy Koch-fazékban. Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél magasabb hőmérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó táptalajok sterilezésekor.

19. A sterilezés berendezései II. Hőlégsterilező: • száraz eszközök (lombikok, Petri-csészék, edények) sterilezésére kialakított szárítószekrény típusú berendezések • Előkészítés, csomagolás (alumínium fólia , fémtok), munkatér megtöltése • Felfűtés • Hőmérséklet kiegyenlítés • Csírátlanítás • Lehűtés Gázégő: a laboratóriumi munka során használt fémeszközök (oltókacs, oltótű, csipesz) sterilezésére szolgál.

20. Sterilezés kémiai módszerekkel A kémiai anyagok hatás alapján csoportosíthatók: bakteriosztatikus hatás baktericid hatás. A hatás az anyagi minőségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidőtől. Kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak. Követelmény: • hatásuk széles spektrumú legyen, • emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélők, • könnyen kezelhetőek és gazdaságosak legyenek. A kémiai sterilezésre használt anyagok: • folyékony • gáz halmazállapotúak. PL: etilén-oxid Az etilén-dioxid előnye, hogy 500 mg/1 koncentrációban 20 °C-on (hideg sterilezés) 4-5 óra alatt sterilez, így hőérzékeny eszközök(pl. hőre lágyuló műanyagok) csíramentesítésére is alkalmas. Hátránya, hogy az etilén-oxid belélegezve tüdőödémát okoz.

21. Plazmasterilizáló A eljárás alacsony, mintegy 464C hőmérsékleten , elektromos erőtér hatására létrehozott hidrogénperoxid plazma-állapotát alkalmazza alacsony páratartalmú közegben csíramentesítésre. A gázalakú plazmát általában az anyag negyedik halmaz-állapotának tekintik, amely ionfelhőből, elektronokból és semleges atomi részecskékből áll. Az anyagnak ez a halmazállapota elektromos erőtér, vagy mágneses erőtér hatására jön létre. (A természetes úton létrejövő plazmára példa a jól ismert természeti jelenség, mely a Föld északi pólusán észlelhető, az aurora borealis, azaz az északi fény.) Az alacsony hőmérsékletű H2O2 plazma aktív szabad gyökei hatékonyan elpusztítják a vírusokat, baktériumokat, spórákat, steril állapotot hozva létre. A folyamat végén vízpára és O2marad vissza, a rakomány száraz, azonnal használható, illetve a hatékony csomagolás révén szállítható és a kívánt ideig tárolható.

22. Sterilezés szűrővel Folyékony és gáz halmazállapotú anyagok szűréssel is sterilezhetők. Pórus átmérők: • bakteriológiában: 0,22-0,65 m között változik • virológiai laboratóriumok25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi ezeket a szűrőket a vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására (ultraszűrés). Korábban a szűrőket égetett agyagból, kovaföldből vagy mázatlan porcelánból készítették, ma már: • A Seitz-féle szűrők azbesztből préselt korongok, egyszer használatosak. • Az üvegszűrők szűrőfelülete préselt üveghab vagy üvegszál. • A membránszűrők cellulóz-észterből készült vékony filterek. Egyszer használatos szűrők. Előnyük, hogy pórusátmérőjük szabályozható, egy-egy szűrőnél valamennyi pórus azonos méretű, a szűrés rajtuk keresztül gyors, a szűrendő folyadékból keveset adszorbeálnak, felhasználásuk sokrétű. Kaphatók ipari szűrésre megfelelő méretű és laboratóriumban használatos formában is (fecskendőre rögzíthető, vákuumszűrésre alkalmas stb). A membránszűrők segédeszközként felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok csíraszámának meghatározásakor is.

23. Sterilezés UV fénnyel A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk csíramentesítésre Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a legjobb baktericid (baktériumölő) hatást a 250-280 nm hullámhosszú sugarakkal érhetjük le, ami főként a DNS-molekulák károsításával magyarázható. Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban, laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére. Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és hatékonyságát a felületeken található szennyeződések a sugárelnyelés révén jelentősen csökkentik. Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a szemet, és karcinogén hatása van, ezért az UV-lámpa üzemeltetésekor lehetőség szerint a helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs mód, UV-fényt szűrő szemüveget kell viselni.

24. Sterilezés ionizáló sugárzással () • A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari méretekben a jó áthatolóképességű, rendszerint kobalt-izotópból származó gamma-sugárzást használják injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és egyes élelmiszerek (fűszerek) sterilezésére. • A gamma-sugárzás előnye, hogy a csomagoláson is áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás - permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak speciális körülmények között alkalmazható.

25. A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI • A mintavétel és előkészítés eszközei • Szilárd mintákból : steril szike, olló és csipesz. • A folyékony minták beméréséhez 10 vagy 20 ml-es steril pipetta • A mintákat sugárzással sterilezett polietilén tasakban homogénezzük

26. A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI Tenyésztőedények • Kémcső • Widal-cső • Erlenmeyer-lombik • Álló lombik • Táptalaj üveg • Roux-palack • Petri-csészék • Durham féle fermentációs cső

27. A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI Oltóeszközök • oltókacs • oltótű, • pipetta • szélesztőbot • automata adagoló pipettákat

28. A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI A mikroszkópos vizsgálat eszközei • tárgylemez • fedőlemez • tárgylemez-csipesz • festőkád vagy festőtálca • számlálókamra