Patrice Crété Laboratoire de Génétique et Biophysique des plantes crete@univmed.fr

1. Patrice Crété Laboratoire de Génétique et Biophysique des plantes crete@univmed.fr La transgenèse végétale: principes et applications.

2. la transgenèse végétale 1 La transgenèse végétale : un outil de la biotechnologie issu de la recherche fondamentale • Biotechnologie • Ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliquées à la recherche et au développement de produits.

3. la transgenèse végétale 2 Principes de la transgenèse végétale Utilisation de la transgenèse végétale : En recherche fondamentale En recherche appliquée

4. la transgenèse végétale 3 Principes de la transgenèse végétale

5. la transgenèse végétale 4 Certaines bactéries infectent les cellules végétales et provoquent des tumeurs ou proliférations cellulaires chez les plantes infectées La galle du collet (crown gall ou « cancer des plantes » ) Viticulture, sylviculture  problèmes

6. la transgenèse végétale 5 Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est causé par une bactérie Agrobacterium tumefaciens Comment la bactérie entraîne une multiplication incontrôlée des cellules végétales ? Réponse trouvée par la découverte des hormones végétales et de l’utilisation de la technique de culture in vitro Deux familles d’hormones permettent aux cellules végétales de se multiplier indéfiniment en culture in vitro Les auxines et les cytokinines Cellules végétales non infectées + auxines + cytokinines Formation de cals

7. la transgenèse végétale 6 Propriétés des cellules de la tumeur Braun montre en 1943 que les cellules de la tumeur peuvent se multiplier indéfiniment en absence de bactéries et en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ). Prélèvement de cellules de la tumeurs et mise en culture in vitro en absence d’auxines et de cytokinines Productions de cals

8. la transgenèse végétale 7 Propriétés des cellules de la tumeurs sans ajout d’hormones ADN-T = ADN de transfert = ADN venant de la bactérie et intégré dans le génome des cellules végétales ADN-T contient des gènes qui s’expriment dans les cellules infectées et qui permettent de produire des auxines et des cytokinines d’où une augmentation anormale des quantités d’hormones

9. la transgenèse végétale 8 D’où vient l’ADN de transfert ou ADN-T ? Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides (200 kb) nécessaires à la formation des tumeurs ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs exemplaires par cellule, plasmide appelé Ti pour Tumor inducing organisation du plasmide Ti d’A. Tumefaciens Vir = région qui contient les gènes de virulence

10. R la transgenèse végétale 9 Système de transformation binaire Description du vecteur binaire ( 10 à 12 Kb)

11. BD BG la transgenèse végétale 10 Les étapes de la transformation génétique du tabac Totipotence chez les végétaux: aptitude pour une cellule végétale à exprimer la totalité des potentialités du génome pour donner un organisme entier

12. la transgenèse végétale 11 Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture, Notion de balance hormonale En concentrations égales  division de cellules indifférenciées = cals Auxine  formation de racines Cytokinines  bourgeons Indole ButyricAcid (IBA)

13. la transgenèse végétale 12 transformation Cellules Disques foliaires ou OGM ou PGM Transmission de l’ADN-T à la génération d’après Intégration aléatoire dans le génome

14. la transgenèse végétale 13 Transformation par électroporation de protoplastes Cellules débarrassées de leur paroi, par traitement enzymatique (cellulases) Nagata et Takebe, 1970 Peuvent se diviser (suivant les conditions) et régénérer des plantes entières Electroporation de l’ADN-T, pas de bactérie : transformation puis régénération de plantes transgéniques

15. la transgenèse végétale 14 ou OGM ou PGM

16. la transgenèse végétale 15 Production de plantes transgéniques d’Arabidopsisthaliana

17. la transgenèse végétale 16 Transformation génétique d’Arabidopsis thaliana par infiltration Stade préfloral Donc au moment de la formation des ovules et du pollen 4 semaines Intégration de l’ADN-T dans l’ovule à différents stades (intégration dans du pollen très rare) (0,1 à 3%) Lors de la génération d’une plante transgénique, l’ADN s’insère dans un seul des chromosomes homologues. Pas de locus correspondant sur l’autre chromosome -> hétérozygote La moitié des gamètes porteront le transgène

18. la transgenèse végétale 17 Applications de la transgenèse végétale

19. la transgenèse végétale 18 Applications en recherche fondamentale 2 exemples 1) Étude de l’activité d’un promoteur 2) Recherche de la fonction d’un gène par modification de son expression (sur ou sous)

20. la transgenèse végétale 19 1) Étude de l’activité d’un promoteur Le gène marqueur de la B-glucuronidase de E.coli (GUS) BLANC BLEU

21. Promoteur A GUS la transgenèse végétale 20 1) Étude de l’activité d’un promoteur - Détails de la construction - Observations Promoteur A

22. Promoteur GFP

23. la transgenèse végétale 21 2) Recherche de la fonction d’un gène par modification de son expression A) Sur-expression Détails de la construction Plante transgénique sur exprimant un gène  implication dans la formation du méristème Plante sauvage

24. la transgenèse végétale 22 B) Sous-expression Stratégie antisens, détails de la construction Plante sauvage Plante transgénique sous exprimant un gène  implication dans l’architecture foliaire

25. la transgenèse végétale 23 Applications de la transgenèse végétale

26. la transgenèse végétale 24 Nombreux domaines d’application Agriculture Agroalimentaire Industries Environnement Santé-pharmacie Introduction de caractéristiques nouvelles et production de molécules d’intérêt Le code génétique est universel, pas de barrière d’espèces

27. la transgenèse végétale 25 Agriculture Résistance aux herbicides, aux insectes et contre certains virus et bactéries Résistance à la pyrale • Par endotoxine (insecticide naturel) de Bacillus thuriengensis (Bt) contre larve de lépidoptère (Pyrale) • protoxine clivée dans l’intestin de l’insecte par protéase + pH alcalin • Toxine active qui se fixe à des sites de l’intestin • ulcération, perte d’appétit • Rupture des cellules, mort des larves Moins d’insecticides chimiques, maïs, tomate, pomme de terre, coton, laitue, peuplier,

28. la transgenèse végétale 26 Agriculture Résistance aux stress (chaleur, froid, sécheresse et salinité) Agroalimentaire Introduction de caractères pour obtenir des avantages nutritionnels, gustatifs Riz doré (golden rice) carence en vitamine A (antioxydant), 400 millions de personnes (cécités, sensibilité accrue aux infections) Introduction de 4 gènes  synthèse de B-carotène (précurseur de la Vit A)

29. la transgenèse végétale 27 Industries Industrie papetière, papier à partir de cellulose du bois, Présence de lignine, imperméable et inextensible  très coûteux à éliminer et source de pollution (utilisation de chlore et consomme une très grande quantité d'eau) Diminution du taux de lignine par transgenèse Coton génétiquement modifiées pour obtenir des vêtements en fibres naturelles moins froissables ou des cotons colorés qui éviteront l'utilisation de teintures nécessitant de nombreux contrôles et des systèmes d'épuration des eaux usées des teintureries lourds et coûteux à mettre en place.

30. la transgenèse végétale 28 Industries Biocarburants Huile de Colza De nouvelles variétés de colza ont été obtenues par transgenèse pour diminuer la viscosité et augmenter l'indice d'octane du diester. Actuellement les huiles représentent seulement 43 % de la masse des graines de colza. Des recherches sont menées pour accroître ce rendement. Le gène qui code l'enzyme intervenant dans la dernière synthèse de l'huile a été isolé. Des copies supplémentaires de ce gène ont été introduites dans du colza. Certaines graines ont ainsi produit une quantité d'huile correspondant à plus de 75 % de leur masse.

31. la transgenèse végétale 29 Santé-pharmacie Production de vaccins, d’anticorps, de protéines (hémoglobine…) Avantage des cellules végétales Plante alternative intéressante comparée aux microorganismes ou aux cellules des mammifères Machinerie cellulaire complexe et sophistiquée Les protéines humaines subissent des modifications post traductionnelles (glycosylation, carboxylation, lipidation) nécessaire à leur activité biologique Ces modifications possibles chez les plantes, difficiles voir impossible chez les bactéries ou levures Plantes non porteuses des agents pathogènes couramment associés aux infections humaines (virus, bactéries)

32. la transgenèse végétale 30 Avantage des cellules végétales Leur contenu cellulaire, hormis la protéine recombinante, connu de l’homme par son utilisation dans l’alimentation, en cosmétique et en pharmacie. - Stockage stable des protéines recombinées dans des endroits stratégiques de la plante (tubercule, feuilles, graines, fruits…) - Facilite l’extraction et la purification • Si protéine recombinante administrée par voie orale, consommation • directe de la plante possible Les plantes peuvent être propagées à l’infini Leur production à grande échelle ou en conditions contrôlées fait partie du patrimoine culturel de toutes les nations Biomasse la moins onéreuse à produire à ce jour par unité de volume

33. la transgenèse végétale 31 Santé-pharmacie Exemples de molécules obtenues Molécules plasmatiques, albumine humaine (HSA) Remplacement d'éléments sanguins (sang "artificiel"), coût de production 5 fois moins élevé que si albumine purifiée à partir du plasma, pas de contaminations Hémoglobine humaine produite à partir de tabac transgénique l'hémoglobine (des biologistes français ont déposé une demande de brevet) Lactoferrine Humaine: protéine multifonctionnelle du lait à activités anti-bactérienne, anti-fongique et anti-virale. (attente d’autorisation de mise sur le marché)

34. la transgenèse végétale 32 Santé-pharmacie Exemples de molécules obtenues Collagène, phase de développement, soigner l'arthrose et aider à la réparation des tissus en cas de chirurgie ou traumatismes Hirudine, puissant inhibiteur de la thrombine utilisée comme anticoagulant, source naturelle la sangsue, production dans graines de colza transgénique, Production de vaccins - Vaccins dit « comestibles » Choléra, production de la sous unité de la toxine dans la pomme de terre Rage: glycoprotéine du virus produit par la tomate

35. la transgenèse végétale 33 Santé-pharmacie Exemples de molécules obtenues Production de vaccins La prochaine pandémie (épidémie planétaire) pourrait être d’origine aviaire (si virus de la grippe aviaire H5N1 muté très contagieux pour l’homme) Vaccin basé sur l’inoculation du virus de la grippe humaine dans des œufs fertilisés ou embryonnés, puis purification du virus et inactivation pour fabriquer 1,2 milliard de doses, il est nécessaire de disposer de... 4 milliards d’oeufs embryonnés et d’au moins six mois au minimum. Il faut aussi des œufs exempts de virus Une autre solution ?  la production chez les plantes

36. Production de ("VLP") Virus-Like Particle dans des plants de tabac pour faire un vaccin contre le virus H5N1 Et pourquoi pas H1N1 Expression transitoire pour production à grande échelle en utilisation des agrobactéries infiltrées dans les feuilles de tabac