Outils chimiques pour l’étude des macromolécules biologiques

1. Outils chimiques pour l’étudedes macromolécules biologiques Marius Réglier Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517 Université Paul Cézanne Aix-Marseille III Faculté des Sciences et techniques Avenue Escadrille Normandie-Niemen 13397 Marseille cedex 20 http://www.lbs.fst.u-3mrs.fr Marius.reglier@univ.u-3mrs.fr

2. I. L’apport de la chimieà la biologie moléculaire

3. Rosalind Franklin Erwin Chargaff Prix Nobel de Medecine en 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins Le 25 avril 1953, Crick et Watson révèlent la structure de l'ADN

4. tRNA traduction Le dogme transcription DNA mRNA protéine réplication

5. L’ADN, deux paires de bases AT, CG

6. Triplex

8. Quadruplex Télomères

9. 5’ T A 3’ C G G C A T 3’ 5’ ADN, deux brins

10. DNA, double hélice

11. Forme B,forme commune dans les conditions physiologiques, faible force ionique et haut dégré d’hydratation (10 paires de bases/tour avec une conformation C2'-endo/anti), deux sillons distincs. Forme Z,(Zigzag) riche en paires G-C, allongée et étroite, possède une unusuelle hélice gauche (12 paires de bases/tour), un seul sillon compact Le Zigzag résulte d’une alternance de purines (C3'-endo/syn) et de pyrimidines (C2'-endo/anti). Forme A-form, aux fortes concentrations en cations ou aux faibles degrés d’hydratation (11 paires de bases/tour, C3'-endo/anti), 2 sillons (1 grand étroit et profond et 1 petit large et peu profond). DNA, polymorphisme

12. DNA, polymorphisme

14. DNA, packaging chromatine nucléosomes Chromosome

16. Réplication

17. Transcription et traduction

18. ARN, deux paires de bases AU, CG ADN ARN

19. 5’ A G C U 3’ ARN, monobrin

20. ARNt

21. Anti-codon

22. Le code universel43 (64) codons pour 20 amino-acides TTT  F Phe      TCT  S Ser      TAT  Y Tyr      TGT  C Cys TTC  F Phe      TCC  S Ser      TAC  Y Tyr      TGC  C Cys TTA  L Leu      TCA  S Ser      TAA  * TerTGA  * Ter TTG  L Leu i    TCG  S Ser      TAG  * Ter      TGG  W Trp CTT  L Leu      CCT  P Pro      CAT  H His      CGT  R Arg CTC  L Leu      CCC  P Pro      CAC  H His      CGC  R Arg CTA  L Leu      CCA  P Pro      CAA  Q Gln      CGA  R Arg CTG  L Leu i    CCG  P Pro      CAG  Q Gln      CGG  R Arg ATT  I Ile      ACT  T Thr      AAT  N Asn      AGT  S Ser ATC  I Ile      ACC  T Thr      AAC  N Asn      AGC  S Ser ATA  I Ile      ACA  T Thr      AAA  K Lys      AGA  R Arg ATG  M Met i   ACG  T Thr      AAG  K Lys      AGG  R Arg GTT  V Val      GCT  A Ala      GAT  D Asp      GGT  G Gly GTC  V Val      GCC  A Ala      GAC  D Asp      GGC  G Gly GTA  V Val      GCA  A Ala      GAA  E Glu      GGA  G Gly GTG  V Val      GCG  A Ala      GAG  E Glu      GGG  G Gly

23. Polymerase ChainReaction (PCR)

24. 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’--ACGTAA---3’+ 5’---AACGTC--3’+ dNTP + TaqPol  5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ --ACGTAA---5’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ dNTP + TaqPol Polymerase Chain Reaction (PCR)

25.  + 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ dNTP + TaqPol 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ + + 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ Polymerase Chain Reaction (PCR) 30 cycles permettent d’amplifier 2 brins d’ADN en 34359738368 exemplaires.

26. Plasmide

27. Enzyme de restriction (EcoRI)CAATTG

28. I.1. Synthèse desoligonucléotides

29. la synthèse chimique des oligonucléotides se fait de 3' vers 5'. Synthèse des oligonucléotides en phase supportée

30. Les dérivés phosphoramidites des 4 nucléotides

31. Etape 1: de-blocking

32. Etape 2: Condensation

33. Etape 3: Capping

34. -----ATGCTAC -----ATGCTA -----ATGCTACG-----ATGCTAG-----ATGCTAC -----ATGCTACGT-----ATGCTAGT-----ATGCTACT -----ATGCTAG Capping -----ATGCTACGTCAACTA----- Sans Avec -----ATGCTACGTCAACTA----- -----ATGCTACGTCAACT -----ATGCTACGTCAAC -----ATGCTACGTCAA -----ATGCTACGTCA -----ATGCTACGTC -----ATGCTACGT -----ATGCTACG

35. Etape 4: Oxydation

36. Etape finale

37. Synthétiseur

38. I.2. Séquençage de l’ADN

40. Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P32 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ La méthode de Maxam and Gilbert 5’-----------------ATGCTACGTCAACTA-----------------3’ 3’-----------------TACGATGCAGTTGAT-----------------5’ Enzyme de restriction (EcoRI) Introduction dans un plasmide

41. Tube 1 + Me2SO4-0.1M NaOH 3’---TACGATGCAGTT 3’---TACGATGCA 3’---TACGAT 3’---TAC Tube 3 + N2H4 3’---TACGATGCAGTTGA 3’---TACGATGCAGT 3’---TACGATGCAG 3’---TACGATG 3’---TACGA 3’---TA 3’--- G Tube 2 + Me2SO4-0.1M HCl 3’---TACGATGCAGTTG 3’---TACGATGCAGTT 3’---TACGATGCA 3’---TACGATGC 3’---TACGAT 3’---TACG 3’---TAC 3’---T C + T Tube 4+ N2H4-NaCl 3’---TACGATG 3’---TA A + G C La méthode de Maxam and Gilbert 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’

42. G T+C A+G C La méthode de Maxam and Gilbert A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

43. Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger

44. Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P32 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGAT -----TACCATGCAGTT -----TACCATGCAGT -----TACCAT -----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGC -----TACC -----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGA -----TACCATGCA -----TACCA -----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTG -----TACCATGCAG -----TACCATG

45. Autoradiographie du gel de séquence ddGTP ddATP ddTTP ddCTP A C G T A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

46. Energie FAM max = 490-495 nm Emmax = 515-520 nm Fluorescence (Diagramme de Jablonski ) S1’ S1 hn hn S0

47. Pigments

48. Dye-labeled primer sequencing colorant attaché en 5’ du primer 2) Internal labeling colorant attaché à un dNTP et incorporé durant la synthèse du nouveau brin d’ADN 3) dye-labeling terminator sequencing colorants attaché à un ddNTP Marquage fluorescent

49. Point d’ancrage du pigment

50. Dye-labeled primer sequencing Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGAT ----TACCATGCAGTT ----TACCATGCAGT ----TACCAT ----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGC ----TACC ----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGA ----TACCATGCA ----TACCA ----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTG ----TACCATGCAG ----TACCATG