1 / 4

Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára

Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1 , FÖLDES Anna 1 ,BORI Erzsébet 1 , LŐRINCZ Ádám 2 , RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya 2 , BARABÁS József 2 , Martin C. STEWARD 3 , VARGA Gábor 1

sirvat
Download Presentation

Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESIOrsolya1, FÖLDESAnna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZÁdám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 , BARABÁSJózsef2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1 1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK Háttér Sjögren szindróma sugárterápia (fej-nyaki tumorok kezelésére) csökkent nyáltermelés hiposzaliváció acinus sejtek pusztulása Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra)Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172 PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra)Szlavik et al. Tissue Eng 2008 14:1915-26 Célkitűzés • humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlítása • optimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásához • transzepitheliális ionáramok vizsgálata • az elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása

  2. Módszerek és eredmények 1200 Hepato-STIM 800 MEM 2 nap TEER (Ωcm2) 400 MEM 1. nap MEM 0 nap 0 0 2 4 6 8 days Sejttenyésztés – primer kultúra • gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok” • egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok” Transzpithelialis rezisztencia mérése huSMG Hepato-STIM PTHSG Hepato-STIM 10x 10x huSMG MEM PTHSG MEM Kulcstranszporterek (RT-CR) 10x 10x NBC1 NKCC1 NHE1 ENaC Pozitív kontroll:K:Vese Minta jelölések: Me: membránról izolált Pl: plasztikról izolált Ti: nyálmirigy szövetből izolált Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (Isc) mérésével • Hepato-STIM medium (BD Biosciences) • MEM medium (Sigma) • 10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma) • Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco) • Transwell Clear (Corning Costar) • Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (WorldPrecision Instruments) • Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.) • Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma) • Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL) • RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem) • HEPES-puffer oldat, 100% O2;HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és Cl—mentes oldat • amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma)

  3. Eredmények K+ Na+ K+ Na+ - - NKA NKA ADP+P ATP ADP+P ATP + + HCO3- K+ ENaC + - + - + + Na Na BAZOLATERALIS OLDAL bumetanid Na+ Na+ Cl- Na+ HCO3- Na+ K+ Cl- CO2 NBC NKCC1 NHE AE DUCT HCO3- H+ CA II CO2+H2O H++HCO3- Ca2+ H2CO3 cAMP PKA II Cl- Cl- ACINI ? CFTR CaCC ATP karbakol forskolin Na+ Cl- Cl- 10 µM amilorid HCO3- APIKALIS OLDAL Klorid és bikarbonát megvonásának hatása Vektoriális iontranszport aktiválása nem stimulált ATP stimulált szekrécióra PTHSG huSMG PTHSG huSMG PTHSG 8 8 8 * * 6 6 6 * * * ∆Isc (µA/cm2) 4 4 ∆Isc (µA/cm2) Isc (µA/cm2) 4 * * 2 2 2 8 8 11 5 4 4 4 8 5 8 6 0 0 0 *p<0,05 *p<0,05 *p<0,05 vs baseline - - HCO3- + HCO3- + forskolin ATP carbachol Cl- + Cl- + - - Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra Apikálisan adott amilorid hatása ATP stimulált szekrécióra nem stimulált 8 PTHSG PTHSG PTHSG huSMG 8 8 6 6 6 * * ∆Isc (µA/cm2) * 4 Isc (µA/cm2) * * 4 ∆ Isc (µA/cm2) 4 2 2 2 5 5 9 9 9 9 3 8 8 8 3 0 0 0 *p<0,05 *p<0,05 *p<0,05 + + - - + + - + + + + HCO3- HCO3-&Cl- HCO3-&Cl- Bum - + - + Ami - + + Ami - + - +

  4. Megbeszélés • Primer sejtkultúra: polarizáltepithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából • Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor • Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában • Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző) • Cl- és HCO3- • Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal • Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző) • Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva: működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas Apikális oldal Transwell Cl-;HCO3ˉ Na+ Bazolaterális oldal Támogatás:TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;

More Related